Բույսերի ուղղակի PCR հավաքածու

Կատուի համարը՝ HCR2020A

Plant Direct PCR Kit-ը հարմար է բույսերի տերևների, սերմերի և այլնի ուղղակի ուժեղացման համար և կարող է օգտագործվել պոլիսախարիդներ և պոլիֆենոլներ չպարունակող բույսերի նմուշների բարձր թողունակությամբ զննման համար:Ուղղորդված էվոլյուցիայի վրա հիմնված ուղղակի ուժեղացման ԴՆԹ պոլիմերազը գերազանց հանդուրժողականություն ունի բույսերի PCR ինհիբիտորների նկատմամբ:Միևնույն ժամանակ, այն պահպանում է ուժեղացման բարձր կատարողականություն, որը հարմար է 5 կբ-ի սահմաններում ԴՆԹ-ի բեկորների ուժեղացման համար:Հավաքածուի եզակի Lysis բուֆեր A-ը կարող է օգտագործվել թարմ կամ սառեցված բույսերի հյուսվածքները լուծելու համար:Այն հեշտ է գործել, և լիզատը կարող է օգտագործվել որպես կաղապար՝ առանց մաքրման ուժեղացման:Համակարգը պարունակում է պաշտպանիչ նյութեր, որոնք թույլ են տալիս չմշակված նմուշները արդյունավետորեն ուժեղացնել կրկնակի սառեցումից և հալվելուց հետո:2 × Plant Direct Master Mix-ին անհրաժեշտ է միայն ավելացնել պրայմերներ և ձևանմուշներ՝ ուժեղացման ռեակցիան իրականացնելու համար՝ դրանով իսկ նվազեցնելով պիպերտավորման գործողությունները և բարելավելով հայտնաբերման թողունակությունը և արդյունքների վերարտադրելիությունը:

Բաղադրիչներ

*Plant Direct Lysis Buffer B-ը կամընտիր ռեագենտ է, որն օգտագործվում է գործարանի ուղղակի լիզի բուֆեր A-ի չեզոքացման համար՝ նմուշների պահպանման ժամանակը երկարացնելու համար:Այն կարող է օգտագործվել ըստ փաստացի իրավիճակի:

Պահպանման պայմանները

2 × Plant Direct Master Mix, պահել -30 ~ -15℃ ջերմաստիճանում և խուսափել կրկնակի սառեցումից և հալեցումից;Բույսերի ուղղակի լիզի բուֆեր, պահեք -30 ~ -15℃ կամ 2 ~ 8℃ ջերմաստիճանում:

Փորձի գործընթաց

Նմուշների մշակում–Բույսի տերեւ

Ուղղակի մեթոդ.Խորհուրդ է տրվում օգտագործել երիտասարդ տերեւներ։Փոքր և միատեսակ նմուշ ստանալու համար օգտագործեք 0,5 – 3 մմ ֆիքսված տրամագծով անցք, այնուհետև ուղղակիորեն ավելացրեք նմուշը PCR համակարգին (խորհուրդ է տրվում 50 μl համակարգ):Ուշադրություն դարձրեք, համոզվեք, որ նմուշը գտնվում է PCR լուծույթում և ոչ թե խողովակի պատին:Եթե ​​ուղիղ PCR-ն օգտագործվում է երկար բեկորների և բարդ նմուշների ուժեղացման համար, ապա ավելի փոքր տրամագծով (0,5 – 1 մմ) նմուշի օգտագործումը որպես ձևանմուշ կարող է օգնել ավելի լավ արդյունքներ ստանալ:

Մանրացման լիզի մեթոդ.Խորհուրդ է տրվում օգտագործել երիտասարդ տերեւներ։Վերցրեք տերևի մի փոքր կտոր (մոտ 1 – 3 մմ տրամագծով), դրեք այն 20 մկլ Plant Direct Lysis Buffer Ab-ի մեջ և հնարավորինս մանրացրեք (այս քայլը կարելի է անել՝ տերևը սեղմելով 100 մկլ խողովակի ծայրով։ նմուշը տրորել):Եթե ​​օգտագործվում են տերևային հյուսվածքի ավելի մեծ ծավալներ (չգերազանցեն 7 մմ), ապա նոսրացման բուֆերի ծավալը հասցրեք մինչև 50 մկլ:Տերեւները աղալուց հետո լուծումը պետք է կանաչ երևա։Կարճ ցենտրիֆուգումից հետո PCR համակարգին ավելացրեք 1 մկլ վերին նյութ՝ որպես ռեակցիայի ձևանմուշ:

Ջերմային լիզի մեթոդ.Խորհուրդ է տրվում օգտագործել երիտասարդ տերեւներ։Վերցրեք տերևի մի փոքր կտոր (մոտ 1 – 3 մմ տրամագծով), դրեք այն 20 մկլ բույսերի ուղղակի լիզի բուֆեր A-ի մեջ և տաքացրեք այն 95°C ջերմաստիճանում 5–10 րոպե:Լուծման ժամանակը կարող է պատշաճ կերպով երկարաձգվել տերևների համար, որոնք դժվար է լուծվում (ոչ ավելի, քան 20 րոպե):Եթե ​​օգտագործվում են տերևային հյուսվածքի ավելի մեծ ծավալներ (չգերազանցեն 7 մմ), ապա նոսրացման բուֆերի ծավալը հասցրեք մինչև 50 մկլ:Տաքացումից հետո կարճ ժամանակով ցենտրիֆուգեք և PCR համակարգին ավելացրեք 1 մկլ վերին նյութ՝ որպես ռեակցիայի ձևանմուշ:

Նմուշների մշակում- Բույսերի սերմեր

Մանրացման լիզի մեթոդ.Օգտագործեք scalpel 5 մմ տրամագծով սերմերը կտրելու համար, դրանք ավելացրեք 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A-ի մեջ և մանրացրեք նմուշը պիպետտի ծայրով կամ այլ գործիքներով:Հակիրճ պտտեցնել և թողնել սենյակային ջերմաստիճանում 3-5 րոպե:Համոզվեք, որ սերմի նմուշը ընկղմված է նոսրացման բուֆերի մեջ:Կարճ ցենտրիֆուգումից հետո PCR համակարգին ավելացրեք 1 մկլ վերին նյութ՝ որպես ռեակցիայի ձևանմուշ:

Ջերմային լիզի մեթոդ.Օգտագործեք scalpel 5 մմ տրամագծով սերմերը կտրելու համար, դրանք ավելացրեք 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A-ի մեջ և տաքացրեք 95°C ջերմաստիճանում 5-10 րոպե:Լուծման ժամանակը կարող է պատշաճ կերպով երկարաձգվել տերևների համար, որոնք դժվար է լուծվում (ոչ ավելի, քան 30 րոպե):Տաքացումից հետո կարճ ժամանակով ցենտրիֆուգեք և PCR համակարգին ավելացրեք 1 մկլ վերին նյութ՝ որպես ռեակցիայի ձևանմուշ:

ա.Մկրատը կամ այլ գործիքները կարող են օգտագործվել նաև համապատասխան չափսի նմուշներ կտրելու համար.եթե դակիչը կամ մկրատը կրկին օգտագործվում են, դրանք պետք է մաքրվեն նատրիումի հիպոքլորիտի 2% լուծույթով յուրաքանչյուր օգտագործումից առաջ՝ նմուշների միջև խաչաձեւ աղտոտումը կանխելու համար:

բ.Օգտագործելուց առաջ համոզվեք, որ Plant Direct Lysis Buffer-ը լիովին հալված է:Եթե ​​բուֆերը մածուցիկ է կամ նստվածքներ ունի, այն կարելի է տաքացնել 37℃ ջերմաստիճանում՝ օգտագործելուց առաջ այն ամբողջությամբ հալեցնելու համար:

գ.Կաղապարի ծավալը ռեակցիայի համակարգում կարող է համապատասխան կերպով ճշգրտվել՝ ըստ բուսական նյութի և ավելացված լուծիչի ծավալների տարբերության:

Բույսերի ուղղակի լիզի բուֆեր

Այս արտադրանքի մեջ պարունակվող Plant Direct Lysis Buffer A-ն խստորեն օպտիմիզացված է բույսերի հյուսվածքների մեծ մասի գենոմը ազատելու համար և հարմար է չմշակված բույսերի կարճաժամկետ պահպանման համար 4℃ ջերմաստիճանում:Եթե ​​նմուշը պետք է պահվի ավելի երկար ժամանակով (օրինակ՝ 1-2 ամիս), ապա խորհուրդ է տրվում տեղափոխել վերին նյութը նոր EP խողովակի մեջ և պահել այն -20℃ ջերմաստիճանում:Նմուշներն ավելի կայուն պահելու համար փոխանցված գերնույն նյութին ավելացրեք Plant Direct Lysis Buffer B հավասար ծավալ, լավ խառնեք և պահեք -20℃ ջերմաստիճանում:Պահպանման կայուն ժամանակը տատանվում է՝ կախված բույսերի նմուշներից և վիճակներից:

Ռեակցիայի համակարգ

ա.Այն պարունակում է Mg²⁺2 մՄ վերջնական կոնցենտրացիայի դեպքում:

բ.Յուրաքանչյուր այբբենարանի համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել 0,4 մկմ վերջնական կոնցենտրացիան:Պրայմերների չափից ավելի օգտագործումը կհանգեցնի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման:

գ.Օգտագործված նմուշի քանակը կարող է ճշգրտվել ըստ փաստացի իրավիճակի:Հում լուծված նմուշի մեկ ռեակցիայում օգտագործվող քանակությունը կարող է ճշգրտվել ռեակցիայի ընդհանուր ծավալի 2%-20%-ի միջև:Չափից շատ նմուշներ օգտագործելը կարող է ուժեղացման ձախողման պատճառ դառնալ:

Ռեակցիայի ծրագիր

ա.Նախնական դենատուրացիան (98℃, 5 րոպե) նպաստում է բույսերի հյուսվածքի լիզմանը` ազատելով գենոմային ԴՆԹ-ն, որը կարող է օգտագործվել PCR ամպլիֆիկացիայի համար:Մի կրճատեք ժամանակը կամ մի իջեցրեք ջերմաստիճանը:

բ.Խորհուրդ է տրվում այն ​​հավասարեցնել այբբենարանի Tm արժեքին կամ Tm արժեքից 2 ~ 4℃ բարձր:Ուղղակի ուժեղացման ԴՆԹ պոլիմերազը, որն օգտագործվում է այս արտադրանքում, տարբերվում է սովորական Taq ԴՆԹ պոլիմերազից և ունի հատուկ պահանջներ եռացման ռեակցիայի ջերմաստիճանի համար: Բարձր եռացման ջերմաստիճանի օգտագործումը կարող է արդյունավետորեն նվազեցնել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը և բարելավել ուժեղացման արդյունավետությունը:Բարդ ձևանմուշների համար արդյունավետ ուժեղացում կարելի է ձեռք բերել՝ կարգավորելով եռացման ջերմաստիճանը և երկարացնելով երկարաձգման ժամանակը:

գ.Եթե ​​ուժեղացման արտադրանքի երկարությունը ≤1 կբ է, երկարացման ժամանակը սահմանվում է 30 վրկ/կբ;եթե ուժեղացման արտադրանքի երկարությունը >1 կբ է, երկարացման ժամանակը սահմանվում է 60 վրկ/կբ:

դ.Բարդ նմուշների կամ ուժեղացման ցածր ելք ունեցող նմուշների համար ցիկլերի թիվը կարող է համապատասխանաբար հասցնել 40-50 ցիկլերի:

Դիմումներ

Այն կիրառելի է բույսերի հյուսվածքների ուղղակի ուժեղացման և պոլիսաքարիդներ և պոլիֆենոլներ չպարունակող բույսերի նմուշների բարձր թողունակության զննման համար:

Նշումներ

Միայն հետազոտական ​​օգտագործման համար:Չի օգտագործվում ախտորոշիչ ընթացակարգերում:

1. Բույսերի չմշակված ուժեղացման կամ ուղղակի ուժեղացման համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել մաքրված գենոմային ԴՆԹ որպես դրական հսկողություն, նախքան փորձարկումը սկսելը, որպեսզի համոզվեք, որ համակարգը, պրայմերները և գործողությունները ճիշտ են:

2. Ուղղակի ուժեղացման ԴՆԹ պոլիմերազը, որն օգտագործվում է այս փաթեթում, ունի ուժեղ սրբագրման ակտիվություն:Եթե ​​անհրաժեշտ է իրականացնել TA կլոնավորում, ապա խորհուրդ է տրվում մաքրել ԴՆԹ-ն ադենին ավելացնելուց առաջ:

3. Primer Design Guide:

ա.Առաջարկվում է, որ այբբենարանի 3′ վերջում վերջին հիմքը լինի G կամ C:

բ.Պետք է խուսափել հաջորդական անհամապատասխանություններից վերջին 8 հիմքերում՝ այբբենարանի 3′ վերջում:գ.Խուսափեք մազակալի կառուցվածքներից այբբենարանի 3′ վերջում:

դ.Առաջատար այբբենարանի և հակադարձ այբբենարանի Tm արժեքի տարբերությունները պետք է լինեն ոչ ավելի, քան 1℃, իսկ Tm արժեքը պետք է ճշգրտվի մինչև 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5-ը խորհուրդ է տրվում հաշվարկել Tm արժեքը):

ե.Լրացուցիչ լրացուցիչ այբբենարանի հաջորդականությունները, որոնք չեն համընկնում կաղապարի հետ, չպետք է ներառվեն այբբենարանի Tm արժեքը հաշվարկելիս:

զ.Առաջարկվում է, որ պրայմերում GC պարունակությունը լինի 40%-60%:

է.A, G, C և T-ի ընդհանուր բաշխումը այբբենարանի մեջ պետք է լինի հնարավորինս հավասար:Խուսափեք օգտագործել բարձր GC կամ AT պարունակությամբ շրջաններ:

հ.Խուսափեք 5 կամ ավելի հիմքերի լրացուցիչ հաջորդականությունների առկայությունից կամ այբբենարանի ներսում կամ երկու այբբենարանների միջև և խուսափեք 3 կամ ավելի հիմքերի լրացուցիչ հաջորդականությունների առկայությունից երկու այբբենարանների 3' վերջում:

ես.Օգտագործեք NCBI BLAST ֆունկցիան՝ ստուգելու այբբենարանի յուրահատկությունը՝ ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը կանխելու համար: