RTL հակադարձ տրանսկրիպտազ
RTL հակադարձ տրանսկրիպտազը ՌՆԹ կաղապարից կախված ԴՆԹ պոլիմերազ է, որը չունի 3'→5' էկզոնուկլեազային ակտիվություն և ունի RNase H ակտիվություն:Այս ֆերմենտը կարող է օգտագործել ՌՆԹ-ն որպես ձևանմուշ՝ ԴՆԹ-ի լրացուցիչ շղթա սինթեզելու համար, որը կարող է կիրառվել առաջին շղթայի cDNA սինթեզի համար, հատկապես RT-LAMP-ի (հանգույցով միջնորդավորված իզոթերմային ուժեղացում):Համեմատած RTL հակադարձ տրանսկրիպտազի 1.0-ի հետ, զգայունությունը զգալիորեն բարելավվել է, ջերմային կայունությունն ավելի ուժեղ է, և ռեակցիան 65°C-ում ավելի կայուն է:RTL հակադարձ տրանսկրիպտազը (գլիցերին ազատ) կարող է օգտագործվել լիոֆիլացված պատրաստուկների, լիոֆիլացված RT-LAMP ռեակտիվների և այլնի պատրաստման համար:
Միավորի սահմանում
Մեկ միավորը ներառում է 1 նմոլ dTTP թթվային նստեցվող նյութի մեջ 20 րոպեում 50°C ջերմաստիճանում, օգտագործելով poly(A)•oligo(dT)25 որպես ձևանմուշ-պրայմեր:
Բաղադրիչներ
| Բաղադրիչ | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL հակադարձ տրանսկրիպտազ (առանց գլիցերինի) (15 U/μL) | 0.1 մլ | 1 մլ | 10 մլ |
| 10×HC RTL բուֆեր | 1,5 մլ | 4×1,5 մլ | 5×10 մլ |
| MgSO4 (100 մՄ) | 1,5 մլ | 2×1,5 մլ | 3×10 մլ |
Պահպանման պայման
Տեղափոխումը մինչև 0°C և պահվում է -25°C~-15°C ջերմաստիճանում:
Որակի հսկողություն
- մնացորդային ակտիվությունEndonuclease:50 μL ռեակցիան, որը պարունակում է 1 μg λDNA և 15 միավոր RTL2.0, ինկուբացված 16 ժամ 37 ℃ ջերմաստիճանում, ցույց է տալիս նույն ձևը, ինչ բացասական վերահսկողությունը գելային էլեկտրոֆորեզով:
- մնացորդային ակտիվությունԷկզոնուկլեազ:50 μL ռեակցիան, որը պարունակում է 1 μg Hind Ⅲ մարսված λDNA և 15 միավոր RTL2.0, ինկուբացված 16 ժամ 37 ℃ ջերմաստիճանում, ցույց է տալիս նույն ձևը, ինչ բացասական վերահսկողությունը գելային էլեկտրոֆորեզով:
- մնացորդային ակտիվությունՆիկաս:50 մկլ ռեակցիան, որը պարունակում է 1 մկգ գերոլորված pBR322 և 15 միավոր RTL2.0, ինկուբացված 4 ժամ 37°C-ում, ցույց է տալիս նույն ձևը, ինչ բացասական հսկողությունը գելային էլեկտրոֆորեզով:
- մնացորդային ակտիվությունRNase:10 մկլ ռեակցիան, որը պարունակում է 0,48 մկգ MS2 ՌՆԹ և 15 միավոր RTL2.0, ինկուբացված 4 ժամ 37°C ջերմաստիճանում, ցույց է տալիս նույն ձևը, ինչ բացասական վերահսկողությունը գելային էլեկտրոֆորեզով:
- E. coli gԴՆԹ:Չափված էE.coliHCD հայտնաբերման հատուկ փաթեթներ, RTL2.0-ի 15 միավորը պարունակում է 1-ից պակասE. coliգենոմը.
Ռեակցիայի կարգավորում
cDNA սինթեզի արձանագրություն
| Բաղադրիչներ | Ծավալը |
| Կաղապար ՌՆԹ ա | ընտրովի |
| Օլիգո (dT) 18~25 (50 մՄ) կամ պատահական այբբենարանի խառնուրդ (60 մՄ) | 2 մլ |
| dNTP խառնուրդ (յուրաքանչյուրը 10 մմ) | 1 մլ |
| RNase inhibitor (40 U/uL) | 0,5 մլ |
| RTL հակադարձ տրանսկրիպտազ 2.0 (15 U/uL) | 0,5 մլ |
| 10×HC RTL բուֆեր | 2 մլ |
| Միջուկազերծ ջուր | Մինչև 20 մլ |
Նշումներ:
1) Ընդհանուր ՌՆԹ-ի առաջարկվող դեղաչափը 1նգ~1մկգ է
2) mRNA-ի առաջարկվող դեղաչափը 50ng~100ng էր
Թերմո-Հեծանվավազք Առօրյա ռեժիմի պայմաններ արձագանք.
| Ջերմաստիճանը (°C) | Ժամանակը |
| 25 °Ca | 5 րոպե |
| 55 °C | 10 րոպեb |
| 80 °C | 10 րոպե |
Նշումներ:
1) Եթե օգտագործվում է Random Primer Mix, ապա ինկուբացիոն քայլ 25°C ջերմաստիճանում:
2) Եթե օգտագործվում է թիրախային այբբենարանի խառնուրդ, ինկուբացիոն քայլ 55°C ջերմաստիճանում 10-30 րոպե:
RT-LAMP արձանագրություն
| Բաղադրիչներ | Ծավալը | Վերջնական համակենտրոնացում |
| Կաղապար ՌՆԹ | ընտրովի | ≥10 օրինակ |
| dNTP Mix (10mM) | 3,5 մլ | 1,4 մմ |
| FIP/BIP այբբենարաններ (25×) | 1 մլ | 1,6 մկմ |
| F3/B3 այբբենարաններ (25×) | 1 մլ | 0,2 մկմ |
| LoopF/LoopB այբբենարաններ (25×) | 1 մլ | 0,4 մկմ |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0,5 մլ | 20 U/Reaction |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 մլ | 7.5 U/Reaction |
| Bst V2 ԴՆԹ պոլիմերազ (8U/μL) | 1 մլ | 8 U/Reaction |
| MgSO4 (100 մՄ) | 1,5 մլ | 6 մմ (Ընդամենը 8 մՄ) |
| 10×HC RTL բուֆեր (կամ 10×HC Bst V2 բուֆեր) | 2,5 մլ | 1 × (2 մմ Mg2+) |
| Միջուկազերծ ջուր | Մինչև 25 մլ | - |
Նշումներ:
1) Խառնել՝ պտտեցնելով և կարճ ժամանակով ցենտրիֆուգ անել՝ հավաքելու համար:Մշտական ջերմաստիճանի ինկուբացիա 65°C-ում 1 ժամ:
2) Երկու բուֆերները փոխգործունակ են և ունեն նույն կազմը:
Նշումներ
1. Այս ապրանքը կձևավորի սպիտակ պինդ, երբ պահվում է -20 °C ջերմաստիճանում:Հանեք այն -20°C-ից և մոտ 10 րոպե դրեք սառույցի վրա։Հալվելուց հետո այն կարելի է օգտագործել թափահարելով և խառնելով։
2. cDNA արտադրանքը կարող է պահվել -20°C կամ -80°C ջերմաստիճանում կամ անմիջապես օգտագործվել PCR ռեակցիայի համար:
3. RNase-ով աղտոտումը կանխելու համար խնդրում ենք մաքուր պահել փորձնական տարածքը և շահագործման ընթացքում կրել մաքուր ձեռնոցներ և դիմակներ:
