Proteinase K NGS (փոշի)
Կատուի համարը՝ HC4507A
NGS Protease K-ը կայուն սերինային պրոտեազ է՝ բարձր ֆերմենտային ակտիվությամբ և սուբստրատի լայն յուրահատկությամբ: Ֆերմենտը նախընտրելիորեն քայքայում է էսթերային կապերը և պեպտիդային կապերը հիդրոֆոբ ամինաթթուների, ծծումբ պարունակող ամինաթթուների և արոմատիկ ամինաթթուների C-տերմինալի մոտ:Այսպիսով, այն հաճախ օգտագործվում է սպիտակուցները կարճ պեպտիդների վերածելու համար:NGS Protease K-ը տիպիկ սերինային պրոթեզերա է Asp-ով39-Նրա69-Սեր224կատալիտիկ եռյակը, որը եզակի է սերինի պրոթեզերոնների համար, և կատալիտիկ կենտրոնը շրջապատված է Ca-ով2+կապող վայրեր կայունացման համար՝ պահպանելով ֆերմենտների բարձր ակտիվությունը ավելի լայն պայմաններում:
Հստակեցում
| Արտաքին տեսք | Սպիտակից մինչև սպիտակ ամորֆ փոշի՝ լիոֆիլացված |
| Հատուկ գործունեություն | ≥40U/mg պինդ |
| DNase | Ոչ մեկը չի հայտնաբերվել |
| RNase | Ոչ մեկը չի հայտնաբերվել |
| Կենսաբեռ | ≤50CFU/գ պինդ |
| Նուկլեինաթթվի մնացորդ | <5 pg/mg պինդ |
Հատկություններ
| Աղբյուր | Tritirachium ալբոմ |
| EC համարը | 3.4.21.64թ(Recombinant Tritirachium ալբոմից) |
| Մոլեկուլային քաշը | 29 կԴա (SDS-PAGE) |
| Իզոէլեկտրական կետ | 7.81 Նկ.1 |
| Օպտիմալ pH | 7.0-12.0 (Բոլորը կատարում են բարձր ակտիվություն) Նկ.2 |
| Օպտիմալ ջերմաստիճան | 65℃ Նկ.3 |
| pH կայունություն | pH 4,5-12,5 (25℃,16ժ) Նկ.4 |
| Ջերմային կայունություն | 50℃-ից ցածր (pH 8.0, 30 րոպե) Նկ.5 |
| Պահպանման կայունություն | Պահպանվում է 25℃ ջերմաստիճանում 12 ամիս Նկ.6 |
| Ակտիվատորներ | SDS, միզանյութ |
| Ինհիբիտորներ | դիիզոպրոպիլ ֆտորոֆոսֆատ;բենզիլսուլֆոնիլ ֆտորիդ |
Պահպանման պայմանները
Պահպանեք լիոֆիլացված փոշին -25~-15℃ ջերմաստիճանում երկար ժամանակ լույսից հեռու;Լուծարելուց հետո ալիվետը համապատասխան ծավալի մեջ դնել կարճաժամկետ պահպանման համար 2-8℃ լույսից հեռու կամ երկարաժամկետ պահպանման համար -25~-15℃ լույսից հեռու:
Նախազգուշական միջոցներ
Օգտագործելիս կամ կշռելիս կրեք պաշտպանիչ ձեռնոցներ և ակնոցներ, իսկ օգտագործելուց հետո լավ օդափոխեք:Այս միջոցը կարող է առաջացնել մաշկի ալերգիկ ռեակցիա և աչքի լուրջ գրգռում:Եթե ներշնչվի, այն կարող է առաջացնել ալերգիայի կամ ասթմայի ախտանիշներ կամ շնչառություն:Կարող է առաջացնել շնչառական գրգռում:
Միավորի սահմանում
NGS Protease K-ի մեկ միավորը սահմանվում է որպես ֆերմենտի քանակություն, որն անհրաժեշտ է կազեինը 1 մկմոլ L-թիրոզինի հիդրոլիզացնելու համար ստանդարտ որոշման պայմաններում:
Ռեակտիվների պատրաստում
| Ռեակտիվ | Արտադրող | Կատալոգ |
| Կազեին տեխնիկականտավարի կաթից | Սիգմա Օլդրիչ | C7078 |
| NaOH | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2Հ2O | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Տրիքլորաքացախաթթու | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Նատրիումի ացետատ | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Քացախաթթու | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Նատրիումի կարբոնատ | Սինոֆարմ ՔիմիքալReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Ֆոլին-ֆենոլ | Sangon Biotech (Շանհայ)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosine | Սիգմա | 93829 |
Ռեակտիվ I:
Ենթաշերտը. 1% կազեին տավարի կաթի լուծույթից. լուծարել 1 գ տավարի կաթի կազեինը 50 մլ 0,1 մ նատրիումի ֆոսֆատի լուծույթում, pH 8,0, տաքացնել ջրային բաղնիքում 65-70 °C 15 րոպե, խառնել և լուծել, սառեցնել ջրով, կարգավորել նատրիումի հիդրօքսիդ մինչև pH 8,0 և նոսրացրեք մինչև 100 մլ:
Ռեակտիվ II:
TCA լուծույթ՝ 0,1 մ տրիքլորքացախաթթու, 0,2 մ նատրիումի ացետատ և 0,3 մ քացախաթթու (կշռել 1,64 գ տրիքլորաքացախաթթու + 1,64 գ նատրիումի ացետատ + 1,724 մլ քացախաթթու հաջորդաբար, ավելացնել 50 մլ դեիոնացված ջուր, կարգավորել pH-ով և նոսրացնել HCl0-ի մեջ: 100 մլ):
Ռեակտիվ III:
0,4 մ նատրիումի կարբոնատի լուծույթ (կշռել 4,24 գ անջուր նատրիումի կարբոնատ և լուծել 100 մլ ջրի մեջ)
Ռեակտիվ IV:
Ֆոլին ֆենոլային ռեակտիվ. նոսրացնել 5 անգամ դեոնացված ջրով:
Ռեակտիվ V:
Ֆերմենտային նոսրացուցիչ՝ 0,1 մ նատրիումի ֆոսֆատի լուծույթ, pH 8,0:
Ռեակտիվ VI:
L-տիրոզին ստանդարտ լուծույթ.0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tyrosine լուծված 0.2M HCl.
Ընթացակարգը
1. Միացրեք UV-Vis սպեկտրոֆոտոմետրը և ընտրեք լուսաչափական չափումը:
2. Սահմանեք ալիքի երկարությունը 660 նմ:
3. Միացրեք ջրային բաղնիքը, ջերմաստիճանը դրեք 37℃, ապահովեք ջերմաստիճանը անփոփոխ 3-5 րոպե:
4. Նախապես տաքացրեք 0,5 մլ սուբստրատը 2 մլ ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ 37℃ ջրային բաղնիքում 10 րոպե:
5. 0,5 մլ նոսրացված ֆերմենտային լուծույթ հանեք նախապես տաքացված ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ 10 րոպեով:Սահմանեք ֆերմենտային նոսրացուցիչը որպես դատարկ խումբ:
6. Ռեակցիայից անմիջապես հետո ավելացրեք 1,0 մլ TCA ռեագենտ:Լավ խառնել և 30 րոպե ինկուբացնել ջրային բաղնիքում։
7. Ցենտրիֆուգային ռեակցիայի լուծույթ:
8. Նշված հերթականությամբ ավելացրեք հետևյալ բաղադրիչները.
| Ռեակտիվ | Ծավալը |
| Գերբնակիչ | 0,5 մլ |
| 0,4 մ Նատրիումի կարբոնատ | 2,5 մլ |
| Ֆոլին ֆենոլային ռեակտիվ | 0,5 մլ |
9. Լավ խառնել նախքան ջրային բաղնիքում 37 աստիճան ջերմաստիճանում 30 րոպե ինկուբացնելը:
10. ՕԴ660 թորոշվել է որպես ՕԴ1;դատարկ հսկիչ խումբ. Ֆերմենտային նոսրացուցիչն օգտագործվում է ֆերմենտային լուծույթը փոխարինելու համար՝ OD որոշելու համար660 թորպես OD2, ΔOD=OD1-ՕԴ2.
11. L-տիրոզինի ստանդարտ կոր՝ 0,5 մլ տարբեր կոնցենտրացիաների L-տիրոզինի լուծույթ, 2,5 մլ 0,4 մ նատրիումի կարբոնատ, 0,5 մլ ֆոլին ֆենոլ ռեագենտ 5 մլ ցենտրիֆուգային խողովակում, ինկուբացնել 37℃-ում 30 րոպե, հայտնաբերել OD660 թL-թիրոզինի տարբեր կոնցենտրացիաների համար, այնուհետև ստացվել է ստանդարտ կորը Y=kX+b, որտեղ Y-ը L-տիրոզինի կոնցենտրացիան է, X-ը՝ OD:600 թ.
Հաշվարկ
2. Ռեակցիայի լուծույթի ընդհանուր ծավալը (մլ)
0.5՝ ֆերմենտային լուծույթի ծավալը (մլ)
0.5. Ռեակցիոն հեղուկի ծավալը, որն օգտագործվում է քրոմոգեն որոշման մեջ (մլ)
10: Արձագանքման ժամանակը (րոպե)
DfԲազմաթիվ նոսրացում
CՖերմենտի կոնցենտրացիան (մգ/մլ)
Ֆիգուրներ
Նկ.1 ԴՆԹ մնացորդ
| Նմուշ | պող C4 | Նուկլեինաթթու Վերականգնում (pg/mg) | Վերականգնում (%) | Ընդհանուր նուկլեին թթու ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| ՌՆԹ ազատ H2O | Չորոշված | — | — | — |
Նկ.2 Օպտիմալ pH
Նկ.3 Օպտիմալ ջերմաստիճան
Նկ.4 pH կայունություն
Նկ.5 Ջերմային կայունություն
Նկ.6 Պահպանման կայունություն 25℃ ջերմաստիճանում
