EndoFree Plasmid Maxi Kit
Այս փաթեթը հարմար է 150 – 300 մլ բակտերիալ լուծույթից արդյունահանելու համար, որը մշակվել է գիշերում, օգտագործելով բարելավված SDS-ալկալային լիզի մեթոդ՝ բակտերիաների լիզման համար:Հում էքստրակտը ընտրովի կերպով համակցվում է եզակի էնդոտոքսին մաքրող նյութի հետ և առանձնացվում է ցենտրիֆուգմամբ՝ էնդոտոքսինները հեռացնելու համար:Այնուհետև սիլիկա գելի թաղանթը ընտրովիորեն կապվում է պլազմիդային ԴՆԹ-ի հետ լուծույթում բարձր աղի և ցածր pH-ի պայմաններում:Դրան հաջորդում է լվացքի բուֆերի ավելացում՝ կեղտերը և այլ բակտերիալ բաղադրիչները հեռացնելու համար:Վերջապես, ցածր աղի, բարձր pH լուծույթի բուֆերն օգտագործվում է մաքուր պլազմիդային ԴՆԹ-ն սիլիցիումի մատրիցային թաղանթից մաքրելու համար:Սիլիկա գելի թաղանթը օգտագործում է հատուկ կլանման թաղանթ, և սյունակի և սյունակի միջև կլանման քանակի տարբերությունը շատ փոքր է, և կրկնվողությունը լավ է:Ֆենոլը, քլորոֆորմը և այլ թունավոր ռեակտիվներ չեն պահանջվում, ինչպես նաև էթանոլային նստեցման քայլեր:Այս փաթեթը կարող է օգտագործվել 0,2-1,5 մգ մաքուր պլազմիդային ԴՆԹ-ի արագ արդյունահանման համար՝ 80%-90% արդյունահանման արագությամբ:Հավաքածուն օգտագործում է եզակի պրոցեսի բանաձև, որը հեռացնում է էնդոտոքսինը, էնդոտոքսինի պարունակությունը չափազանց ցածր է, իսկ բջիջների փոխակերպման ազդեցությունը գերազանց է:Արդյունահանված պլազմիդը կարող է ուղղակիորեն օգտագործվել ֆերմենտների մարսողության, PCR-ի, in vitro արտագրման, փոխակերպման, հաջորդականության և մոլեկուլային կենսաբանության այլ փորձերում:
Պահպանման պայմանները
RNaseA-ն պետք է պահվի -30 ~ -15℃ ջերմաստիճանում և տեղափոխվի ≤0℃ ջերմաստիճանում:
Endotoxin Scavenger-ը կարելի է պահել 2 ~ 8℃ ջերմաստիճանում մեկ ամիս, պահել -30 ~ -15℃ երկարատև պահպանման համարև տեղափոխվում է ≤0℃:
Այլ բաղադրիչները պետք է պահվեն սենյակային ջերմաստիճանում (15 ~ 25℃) և տեղափոխվեն սենյակային ջերմաստիճանում:
Բաղադրիչներ
| Բաղադրիչներ | 10RXNS |
| RNase A | 750 մլ |
| Բուֆեր P1 | 75 մլ |
| Բուֆեր P2 | 75 մլ |
| Բուֆեր P4 | 75 մլ |
| Էնդոտոքսին մաքրող | 25 մլ |
| Բուֆերային PW | 2 × 22 մլ |
| Բուֆերային տուբերկուլյոզ | 20 մլ |
| FastPure DNA Maxi սյունակներ (յուրաքանչյուրը 50 մլ հավաքածուի խողովակում) | 10 |
| Էնդոտոքսին առանց հավաքածուի խողովակ | 2 × 5 |
RNaseA:10 մգ/մլ, օգտագործվում է ՌՆԹ-ն հեռացնելու համար:
Բուֆեր P1:բակտերիալ կասեցման բուֆեր, առաջին օգտագործումից առաջ ավելացրեք RNaseA բուֆեր P1-ին:
Բուֆեր P2:բակտերիաների լիզի բուֆեր (պարունակում է SDS/NaOH):
Բուֆեր P4:չեզոքացնող բուֆեր:
Էնդոտոքսին մաքրող.արդյունավետորեն հեռացնում է էնդոտոքսինը չմշակված պլազմիդի էքստրակտից:
Բուֆերային PW:լվանալ բուֆերը, առաջին օգտագործումից առաջ ավելացնել էթանոլի սահմանված ծավալը:
Բուֆերային ՏԲ.էլյուցիոն բուֆեր:
FastPure DNA Maxi սյունակներ.պլազմիդային ԴՆԹ-ի կլանման սյունակներ:
Հավաքածուի խողովակներ 50 մլ:ֆիլտրատի հավաքման խողովակներ:
Endotoxin-free Collection Tube:պլազմիդային ԴՆԹ հավաքման խողովակներ.
Պատրաստված նյութեր
Բացարձակ էթանոլ, իզոպրոպանոլ, 50 մլ կլոր հատակով ցենտրիֆուգային խողովակներ և 50 մլ առանց էնդոտոքսինիցենտրիֆուգային խողովակներ.
Դիմումներ
Այս արտադրանքը հարմար է 150-300 մլ բակտերիալ լուծույթից պլազմիդների լայնածավալ արդյունահանման համար:կուլտուրա մեկ գիշերում:
Փորձի գործընթաց
1. Վերցրեք 150 – 200 մլ (300 մլ-ից ոչ ավելի) բակտերիալ լուծույթ, որը մշակվել է գիշերը և ցենտրիֆուգեքմոտ 11000 ռ/րոպ (12000 × գ) 1-2 րոպեի ընթացքում:Վերցրեք վերը նշված նյութը և հավաքեք բակտերիաներ:
Δ 50 մլ-ից ավելի բակտերիալ լուծույթ հավաքելիս բակտերիաները կարող են հավաքվել՝ ավելացնելով բակտերիալ լուծույթ, ցենտրիֆուգացիա, վերնաթաթը դեն նետելով և այլ քայլեր նույն 50 մլ խողովակում։
մի քանի անգամ:
2. Ցենտրիֆուգին ավելացրեք 7,5 մլ բուֆեր P1 (խնդրում ենք ստուգել՝ արդյոք RNaseA-ն ավելացվել է բուֆեր P1-ին)մանրէներ պարունակող խողովակ և մանրակրկիտ խառնել հորձանուտով կամ խողովակով:
Δ Այս քայլում բակտերիաների ամբողջական վերասպենսենսիան շատ կարևոր է արդյունքի հասնելու համար, և նորից կասեցումից հետո բակտերիաների կուտակումներ չպետք է լինեն:Եթե կան բակտերիալ կուտակումներ, որոնք մանրակրկիտ խառնված չեն, դա կազդի լիզի վրա, ինչը հանգեցնում է ցածր բերքատվության և մաքրության:Եթե բակտերիալ լուծույթի OD600-ը 0,65 է, ապա խորհուրդ է տրվում օգտագործել 7,5 մլ բուֆեր P1 150 մլ բակտերիալ լուծույթից հանելիս;երբ OD600-ը 0,75 է, պետք է օգտագործվի 8 մլ բուֆեր P1 և համապատասխանաբար փոխվեն բուֆերների P2 և P4 ծավալները:Եթե բակտերիալ լուծույթի ծավալը հասցվում է մինչև 200 մլ, ապա խորհուրդ է տրվում, որP1, P2 և P4 բուֆերների ծավալը պետք է ավելացվի համամասնորեն:
3. Ավելացրեք 7,5 մլ բուֆեր P2 բակտերիալ կախույթին 2-րդ քայլից և նրբորեն խառնեք վերև վար 6-8 անգամ:անգամ և ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանում 4-5 րոպե:
Δ Մեղմորեն շրջեք, որպեսզի մանրակրկիտ խառնվի:Պտտումը կհանգեցնի գենոմային ԴՆԹ-ի մասնատմանը, ինչը կհանգեցնի գենոմային ԴՆԹ-ի բեկորների արդյունահանված պլազմիդի մեջ:Այս պահին լուծույթը դառնում է մածուցիկ և կիսաթափանցիկ՝ ցույց տալով, որ բակտերիաները լիովին լուծվել են:Տևողությունը չպետք է գերազանցի 5 րոպեը՝ պլազմիդների ոչնչացումից խուսափելու համար:Եթե լուծումը պարզ չէ, կարող է առաջանալ չափազանց շատ բակտերիաներթերի լիզը, ուստի բակտերիաների քանակը պետք է համապատասխանաբար կրճատվի:
4. Ավելացրեք 7,5 մլ բուֆեր P4 բակտերիալ կախույթին 3-րդ քայլից և անմիջապես շրջեք 6-8 անգամ, որպեսզի լուծույթն ամբողջությամբ չեզոքացնի բուֆեր P2-ը:Այս պահին պետք է հայտնվի սպիտակ ճկուն նստվածք:Ցենտրիֆուգեք ավելի քան 11000 պտ/րոպե արագությամբ (12000 × գ) 10-15 րոպե, զգուշորեն պտտեք վերին հեղուկը նոր 50 մլ կլոր հատակով ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ (ինքնապատրաստված) և խուսափեքներծծել լողացող սպիտակ նստվածքը:
Δ Ավելացնել բուֆեր P4 և անմիջապես շրջել, որպեսզի լավ խառնվի:Խողովակը թողեք կանգնի այնքան ժամանակ, մինչև սպիտակ նստվածքը հավասարաչափ բաշխվի լուծույթում` կանխելու տեղական տեղումների առաջացումը, որը կարող է ազդել չեզոքացման վրա:Եթե ցենտրիֆուգումից առաջ չկա միատեսակ սպիտակ ճկուն նստվածք, և ցենտրիֆուգումից հետո վերին նյութը պարզ չէ, ապա խողովակը կարող է լինել.ցենտրիֆուգվել ևս 5 րոպե:
5. 4-րդ քայլից վերին նյութին ավելացրեք էնդոտոքսին մաքրող նյութի 0, 1 անգամ ավելի ծավալը (վերածանցի ծավալի 10%-ը, մոտ 2,2 մլ) և շրջեք խառնելու համար:Լուծույթը դրեք սառցե լոգանքի մեջ կամ դրեք մանրացված սառույցի (կամ սառնարանի սառնարանի) մեջ 5 րոպե, մինչև լուծույթը պղտորից փոխվի թափանցիկ և թափանցիկ (կամ անշարժմի փոքր պղտոր), և երբեմն մի քանի անգամ խառնել:
Δ Այն բանից հետո, երբ էնդոտոքսին մաքրող նյութը ավելացվի վերին նյութին, վերը նշվածը կդառնա պղտոր, բայցՍառցե լոգարանում սառչելուց հետո վերը պետք է թափանցիկ (կամ թեթևակի պղտոր) դառնա:
6. Սենյակային ջերմաստիճանում (>25℃) 10 – 15 րոպե տեղադրվելուց հետո այն կպղտորվինրա ջերմաստիճանը բարձրանում է սենյակային ջերմաստիճանի:Այնուհետև վերին նյութը պետք է շրջվի, որպեսզի խառնվի:
Δ Եթե սենյակային ջերմաստիճանն ավելի ցածր է կամ ցանկանում եք նվազեցնել արդյունահանման ժամանակը, ապա վերին նյութը կարող է ինկուբացվել 37 ~ 42 ℃ ջրային բաղնիքում 5 – 10 րոպե, իսկ հաջորդ քայլը կարող է իրականացվել վերնահերթից հետո։դառնում է պղտոր.
7. Սուպերնատենտը ցենտրիֆուգեք մոտավորապես 11000 ռ/րոպե արագությամբ (12000 × գ) 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում (ջերմաստիճանը պետք է լինի >25℃)՝ փուլը բաժանելու համար:Վերին ջրային փուլը պարունակում է ԴՆԹ, իսկ ստորին կապույտ յուղոտ փուլային շերտը պարունակում է էնդոտոքսին և այլ կեղտեր:ՓոխանցելԴՆԹ պարունակող ջրային փուլ դեպի նոր խողովակ ևհեռացնել յուղոտ շերտը:
Δ Ցենտրիֆուգման ժամանակ ջերմաստիճանը պետք է լինի ավելի քան 25℃, քանի որ արդյունավետ փուլային տարանջատումը չի լինումտեղի է ունենում, եթե ջերմաստիճանը շատ ցածր է:
Δ Եթե փուլային տարանջատումը արդյունավետ չէ, ապա ցենտրիֆուգման ջերմաստիճանը կարող է կարգավորվել մինչև 30℃ ևցենտրիֆուգման ժամանակը կարող է ավելացվել մինչև 15 րոպե:
Δ Մի ծծեք կապույտ յուղոտ շերտը, քանի որ այն պարունակում է էնդոտոքսին և այլ կեղտեր:
Մեխանիզմ
Resuspension Lysis չեզոքացում
◇ Ավելացնել 7,5 մլ բուֆեր P1
◇ Ավելացնել 7,5 մլ բուֆեր P2
◇ Ավելացնել 7,5 մլ բուֆեր P4
Էնդոտոքսինի հեռացում
◇Ավելացրեք Էնդոտոքսին մաքրող նյութի վերին նյութի ծավալը 0.1 անգամ
Կապում և լվացում
◇ Ավելացրեք իզոպրոպանոլի ծավալը 0,5 անգամ
◇ Ավելացնել 10 մլ բուֆեր PW
◇ Ավելացնել 10 մլ բուֆեր PW
Էլյուցիան
◇ Ավելացնել 1 – 2 մլ բուֆերային տուբերկուլյոզ կամ էնդոտոքսին առանց ddH2O
