Proteinase K (հեղուկ)
Կատուի համարը՝ HC4502A
Proteinase K-ն կայուն սերինային պրոթեզերա է՝ լայն սուբստրատի առանձնահատկությունով:Այն քայքայում է բազմաթիվ սպիտակուցներ բնիկ վիճակում նույնիսկ լվացող միջոցների առկայության դեպքում:Բյուրեղների և մոլեկուլային կառուցվածքի ուսումնասիրությունների ապացույցները ցույց են տալիս, որ ֆերմենտը պատկանում է սուբտիլիսինների ընտանիքին ակտիվ տեղամասի կատալիտիկ եռյակով (Asp39-Նրա69- Սեր224).Պառակտման գերակշռող տեղը պեպտիդային կապն է, որը հարում է ալիֆատիկ և արոմատիկ ամինաթթուների կարբոքսիլ խմբին՝ արգելափակված ալֆա ամինո խմբերով:Այն սովորաբար օգտագործվում է իր լայնկոնկրետություն։
Հստակեցում
| Արտաքին տեսք | Անգույնից բաց շագանակագույն հեղուկ |
| Գործունեություն | ≥800 U/ml |
| Սպիտակուցի կոնցենտրացիան | ≥20 մգ/մլ |
| DNase | Ոչ մեկը չի հայտնաբերվել |
| RNase | Ոչ մեկը չի հայտնաբերվել |
Պահպանման պայմանները
Պահել 2-8℃ ջերմաստիճանում։
Հատկություններ
| EC համարը | 3.4.21.64 (Ռէկոմբինանտ Tritirachium ալբոմից) |
| Մոլեկուլային քաշը | 29 կԴա (SDS-PAGE) |
| Իզոէլեկտրական կետ | 7.81 |
| Օպտիմալ pH | 7.0-12.0 Նկ.1 |
| Օպտիմալ ջերմաստիճան | 65 ℃ Նկ.2 |
| pH կայունություն | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 ժ) Նկար 3 |
| Ջերմային կայունություն | 50℃-ից ցածր (pH 8.0, 30 րոպե) Նկ.4 |
| Ակտիվատորներ | SDS, միզանյութ |
| Ինհիբիտորներ | դիիզոպրոպիլ ֆտորոֆոսֆատ;ֆենիլմեթիլսուլֆոնիլ ֆտորիդ |
Դիմումներ
1. Գենետիկ ախտորոշիչ հավաքածու
2. ՌՆԹ-ի և ԴՆԹ-ի արդյունահանման փաթեթներ
3. Հյուսվածքներից ոչ սպիտակուցային բաղադրիչների հեռացում, սպիտակուցային կեղտերի քայքայում, ինչպիսիք են ԴՆԹ պատվաստանյութերը և հեպարինի պատրաստումը
4. Քրոմոսոմի ԴՆԹ-ի պատրաստում իմպուլսային էլեկտրոֆորեզով
5. Western blot
6. Ֆերմենտային գլիկոզիլացված ալբումինի ռեագենտներ in vitro ախտորոշում
Նախազգուշական միջոցներ
Օգտագործելիս կամ կշռելիս կրեք պաշտպանիչ ձեռնոցներ և ակնոցներ, իսկ օգտագործելուց հետո լավ օդափոխեք:Այս միջոցը կարող է առաջացնել մաշկի ալերգիկ ռեակցիա և աչքի լուրջ գրգռում:Եթե ներշնչվի, այն կարող է առաջացնել ալերգիայի կամ ասթմայի ախտանիշներ կամ շնչառություն:Կարող է առաջացնել շնչառական գրգռում:
Փորձարկում
Միավորի սահմանում
Մեկ միավորը (U) սահմանվում է որպես ֆերմենտի քանակություն, որն անհրաժեշտ է կազեինի հիդրոլիզացման համար՝ րոպեում 1 մկմոլ թիրոզին արտադրելու համար հետևյալ պայմաններում.
Ռեակտիվների պատրաստում
Ռեակտիվ I. 1 գ կաթի կազեինը լուծվել է 50 մլ 0,1 մ նատրիումի ֆոսֆատի լուծույթում (pH 8,0), ինկուբացրել են 65-70 ℃ ջրի մեջ 15 րոպե, խառնել և լուծվել, սառչել ջրով, նատրիումի հիդրօքսիդով կարգավորվել pH 8,0 և ամրացվել: ծավալը 100մլ.
Ռեակտիվ II՝ TCA լուծույթ՝ 0,1 մ տրիքլորքացախաթթու, 0,2 մ նատրիումի ացետատ, 0,3 մ քացախաթթու:
Ռեակտիվ III՝ 0.4M Na2CO3լուծում.
Ռեակտիվ IV. Ֆորինտի ռեակտիվը 5 անգամ նոսրացված է մաքուր ջրով:
Ռեակտիվ V. Ֆերմենտային նոսրացուցիչ՝ 0,1 մ նատրիումի ֆոսֆատի լուծույթ (pH 8,0):
Ռեակտիվ VI՝ տիրոզինի լուծույթ՝ 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 մմոլ/մլ թիրոզին՝ լուծված 0,2 մ HCl-ով։
Ընթացակարգը
1. 0,5 մլ ռեակտիվ I-ը նախապես տաքացվում է մինչև 37℃, ավելացնում ենք 0,5 մլ ֆերմենտային լուծույթ, լավ խառնում և ինկուբացնում 37℃ ջերմաստիճանում 10 րոպե:
2. Ռեակցիան դադարեցնելու համար ավելացրեք 1 մլ ռեագենտ II, լավ խառնեք և շարունակեք ինկուբացիան 30 րոպե:
3. Ցենտրիֆուգային ռեակցիայի լուծույթ:
4. Վերցրեք 0,5 մլ վերին նյութ, ավելացրեք 2,5 մլ ռեակտիվ III, 0,5 մլ ռեակտիվ IV, լավ խառնեք և ինկուբացրեք 37℃ ջերմաստիճանում 30 րոպե:
5. ՕԴ660 թորոշվել է որպես ՕԴ1;դատարկ հսկիչ խումբ. 0.5 մլ ռեակտիվ V օգտագործվում է ֆերմենտային լուծույթը փոխարինելու համար՝ OD որոշելու համար660 թորպես OD2, ΔOD=OD1-ՕԴ2.
6. L-տիրոզինի ստանդարտ կոր. 0,5 մլ տարբեր կոնցենտրացիաների L-տիրոզինի լուծույթ, 2,5 մլ ռեակտիվ III, 0,5 մլ ռեագենտ IV 5 մլ ցենտրիֆուգային խողովակում, ինկուբացնել 37℃-ում 30 րոպե, հայտնաբերել OD660 թL-թիրոզինի տարբեր կոնցենտրացիաների համար, այնուհետև ստացվեց ստանդարտ կորը Y=kX+b, որտեղ Y-ը L-թիրոզինի կոնցենտրացիան է, X-ը՝ OD:600 թ.
Հաշվարկ
2. Ռեակցիայի լուծույթի ընդհանուր ծավալը (մլ)
0.5՝ ֆերմենտային լուծույթի ծավալը (մլ)
0.5. Ռեակցիոն հեղուկի ծավալը, որն օգտագործվում է քրոմոգեն որոշման մեջ (մլ)
10: Արձագանքման ժամանակը (րոպե)
DfԲազմաթիվ նոսրացում
CՖերմենտի կոնցենտրացիան (մգ/մլ)
Հղումներ
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Բիոֆիզ.Ռես.կոմուն.(1971);44:513.
3. Հիլզ, Հ.և այլն,Եվր.J. Biochem.(1975);56։103–108։
4. Սեմբրուկ Ջet ալ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989):
Ֆիգուրներ
Նկ. 1 Օպտիմալ pH
100մՄ բուֆերային լուծույթ՝ pH6.0-8.0, Na-ֆոսֆատ;pH8.0- 9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Ֆերմենտի կոնցենտրացիան՝ 1մգ/մլ
Նկ. 2 Օպտիմալ ջերմաստիճան
Ռեակցիա 20 մՄ K-ֆոսֆատ բուֆերային pH 8.0:Ֆերմենտի կոնցենտրացիան՝ 1մգ/մլ
Նկ. 3 pH Կայունություն
25℃,16 ժ-բուժում 50մՄ բուֆերային լուծույթով. pH 4,5-5,5, ացետատ;pH 6,0-8,0, Na-ֆոսֆատ;pH 8,0-9,0, տրիս-HCl.pH 9,0-12,5, Glycine-NaOH:Ֆերմենտի կոնցենտրացիան՝ 1մգ/մլ
Նկ. 4 Ջերմային կայունություն
30 րոպե բուժում 50 մՄ Tris-HCl բուֆերով, pH 8.0:Ֆերմենտի կոնցենտրացիան՝ 1մգ/մլ
Նկ. 5 Պահպանում կայունty at 25℃
