Rnase արգելակիչ
Մկների RNase ինհիբիտորը մկների RNase-ի ռեկոմբինանտ է, որը արտահայտված և մաքրված է E.coli-ից:Այն կապվում է RNase A, B կամ C-ի հետ 1:1 հարաբերակցությամբ ոչ կովալենտային կապի միջոցով՝ դրանով իսկ արգելելով երեք ֆերմենտների ակտիվությունը և պաշտպանելով ՌՆԹ-ն քայքայումից:Այնուամենայնիվ, Այն արդյունավետ չէ RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H կամ RNase-ի դեմ Aspergillus-ից:Մկների RNase ինհիբիտորը փորձարկվել է RT-PCR, RT-qPCR և IVT mRNA-ով և համատեղելի է տարբեր առևտրային հակադարձ տրանսկրիպտազների, ԴՆԹ պոլիմերազների և ՌՆԹ պոլիմերազների հետ:
Համեմատած մարդկային RNase ինհիբիտորների հետ, մկների RNase ինհիբիտորը չի պարունակում երկու ցիստեին, որոնք խիստ զգայուն են օքսիդացման նկատմամբ, որն առաջացնում է արգելակիչի անակտիվացում:Դա այն դարձնում է կայուն DTT-ի ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում (1 մՄ-ից պակաս):Այս հատկությունը դարձնում է այն պիտանի օգտագործման համար այն ռեակցիաներում, որտեղ DTT-ի բարձր կոնցենտրացիաները բացասաբար են ազդում ռեակցիայի վրա (օրինակ՝ իրական ժամանակում RT-PCR):
Aդիմում
Այս արտադրանքը կարող է լայնորեն օգտագործվել ցանկացած փորձի ժամանակ, որտեղ RNase-ի միջամտությունը հնարավոր է ՌՆԹ-ի քայքայումից խուսափելու համար, օրինակ՝
1.cDNA-ի առաջին շղթայի սինթեզ, RT-PCR, RT-qPCR և այլն:
2.Պաշտպանում է ՌՆԹ-ն դեգրադացիայից in vitro տրանսկրիպցիայի/թարգմանության ժամանակ (օրինակ՝ in vitro վիրուսների վերարտադրման համակարգ):
3.RNase-ի ակտիվության արգելակում ՌՆԹ-ի տարանջատման և մաքրման ժամանակ:
Պահպանման պայմանները
Ապրանքը կարող է պահվել -25-15℃ ջերմաստիճանում, ուժի մեջ է 2 տարի:
Պահպանման բուֆեր
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT և 50% գլիցերին:
Միավորի սահմանում
Մկների RNase ինհիբիտորի քանակը, որն անհրաժեշտ է 5 նգ ռիբոնուկլեազ A-ի ակտիվությունը 50%-ով արգելակելու համար, սահմանվել է որպես մեկ միավոր (U):
Սպիտակուցի մոլեկուլային քաշը
Մկների RNase ինհիբիտորի մոլեկուլային քաշը 50 կԴա է:
Որակի հսկողություն
Էկզոնուկլեազ Գործունեություն:
40 U մկների RNase ինհիբիտորը 1 μg λ-Hind III մարսող ԴՆԹ-ի հետ 37℃ 16 ժամվա ընթացքում չի տալիս քայքայումը, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:
Էնդոնուկլեազի ակտիվություն.
40 U մկների RNase ինհիբիտորը 1μg λ ԴՆԹ-ով 37℃ 16 ժամվա ընթացքում չի տալիս քայքայումը, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:
Նիկինգ Գործունեություն:
Մկների RNase-ի 40U ինհիբիտորը 1μg pBR322-ով 37℃-ով 16 ժամվա ընթացքում չի տալիս քայքայումը, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզով:
RNase Գործունեություն:
Մկների RNase ինհիբիտորի 40U-ը 1,6 μg MS2 ՌՆԹ-ով 4 ժամ 37℃ ջերմաստիճանում չի տալիս դեգրադացիա, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:
E.coli ԴՆԹ:
40 U մկների RNase ինհիբիտորը զննվում է E. coli գենոմային ԴՆԹ-ի առկայության համար՝ օգտագործելով TaqMan qPCR E. coli 16S rRNA տեղանքի համար հատուկ պրայմերներով:E. coli-ի գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը ≤ 0,1 pg/40 U է:
Nօտեs
1. Բռնի տատանումը կամ խառնումը կհանգեցնի ֆերմենտի ապաակտիվացման:
2. Այս արգելակիչի օպտիմալ ջերմաստիճանի միջակայքը եղել է 25-55 ℃, և այն ապաակտիվացվել է 65℃ և բարձր ջերմաստիճանում:
3. RNase H, RNase 1 և RNase T1-ի գործունեությունը չի արգելակվել մկների RNase-ի ինհիբիտորի կողմից:
4. RNase-ի ակտիվության արգելակումը հայտնաբերվել է pH-ի լայն տիրույթում (pH 5-9 բոլորը ակտիվ էին), իսկ ամենաբարձր ակտիվությունը նկատվել է pH 7-8-ում:
5. Քանի որ ռիբոնուկլեազները սովորաբար պահպանում են ակտիվությունը դենատուրացնող պայմաններում, պետք է ուշադրություն դարձնել, որպեսզի խուսափեն RNase Inhibitor-ի մոլեկուլների դենատուրացիայից, որոնք կոմպլեքսավորված են ռիբոնուկլեազի հետ:Ակտիվ ռիբոնուկլեազի արտազատումը կանխելու համար պետք է խուսափել 50 °C-ից բարձր ջերմաստիճաններից և միզանյութի կամ այլ դենատուրացնող նյութերի բարձր կոնցենտրացիաներից:
