ԴՆԹ-ի արդյունահանման մինի հավաքածու
Այս հավաքածուն ընդունում է օպտիմիզացված բուֆերային համակարգ և սիլիկա գելի սյունակի մաքրման տեխնոլոգիա, որը կարող է վերականգնել 70 bp – 20 kb ԴՆԹ-ի բեկորները TAE կամ TBE ագարոզայի գելի տարբեր կոնցենտրացիաներից:ԴՆԹ-ի կլանման սյունակը կարող է հատուկ կլանել ԴՆԹ-ն աղի բարձր պայմաններում:Բացի այդ, փաթեթը կարող է ուղղակիորեն մաքրել ԴՆԹ-ի բեկորները PCR արտադրանքներից, ֆերմենտային ռեակցիայի համակարգերից կամ այլ մեթոդներով ստացված անմշակ ԴՆԹ արտադրանքներից և հեռացնել կեղտերը, ինչպիսիք են սպիտակուցները, այլ օրգանական միացությունները, անօրգանական աղի իոնները և օլիգոնուկլեոտիդային պրայմերները:Այն կարող է ապահովել, որ մաքրումը կարող է ավարտվել 10-15 րոպեի ընթացքում:Մաքրված ԴՆԹ-ն կարող է օգտագործվել ուղղակիորեն կապակցման, փոխակերպման, ֆերմենտի մարսողության, in vitro տրանսկրիպցիայի, PCR-ի, հաջորդականացման, միկրոներարկման և այլնի համար:
Պահպանման պայմանները
Պահել -15 ~ -25℃ ջերմաստիճանում և տեղափոխել սենյակային ջերմաստիճանում:
Բաղադրիչներ
| Բաղադրիչներ | (100 rxns) |
| Բուֆերային ՀՆԱ | 80 մլ |
| Բուֆերային GW | 2 × 20 մլ |
| Elution Buffer | 20 մլ |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Բուֆերային ՀՆԱ:ԴՆԹ կապող բուֆեր.
Բուֆերային GW:Լվացքի բուֆեր;Օգտագործելուց առաջ ավելացրեք բացարձակ էթանոլ շշի վրա նշված ծավալով:
Elution Buffer:Էլյուցիան.
FastPure DNA Mini Columns-G:ԴՆԹ-ի կլանման սյունակներ.
Հավաքածուի խողովակներ 2 մլ:Հավաքածուներ ֆիլտրատի համար:
Պատրաստված նյութեր
1,5 մլ ստերիլիզացված խողովակներ, բացարձակ էթանոլ և իզոպրոպանոլ (երբ ԴՆԹ-ի հատվածը ≤100 bp է, ավելացրեք 1 ծավալ
իզոպրոպանոլից մինչև 1 ծավալով գել), ջրային բաղնիք։
Փորձի գործընթաց
Օգտագործելուց առաջ ավելացնել 80 մլ էթանոլ բուֆերային GW-ի նոսրացման համար, ինչպես նշված է պիտակի վրա, պահել սենյակային ջերմաստիճանում:
Մեխանիզմ
1. PCR ռեակցիայի լուծույթ
Գելի արդյունահանման սխեման. Ավելացնել հավասար ծավալի բուֆերային GDP PCR ռեակցիայի լուծույթի վերականգնման սխեմա.5 անգամ ավելացրեք բուֆերի ծավալը
2. ՀՆԱ Հաշվարկել գելի ծավալը (100 μլ հավասար է 100 մգ)
Լուծել գել
3. Նախապես տաքացրեք 50-55℃
4. Բինդ Լվացք
Ավելացնել 300 մկլ բուֆերային ՀՆԱ*
Ավելացնել 700 մլ բուֆեր GW
Ավելացնել 700 մլ բուֆեր GW
5. Էլյուտ
Ավելացրեք 20 – 30 մկլ լուծույթի բուֆեր կամ դեիոնացված ջուր
Ծանոթագրություններ* PCR ռեակցիայի հեղուկի վերականգնում առանց այս քայլի
Գելի արդյունահանման ծրագիր
1. ԴՆԹ-ի բեկորների ֆրակցիոնացման համար ԴՆԹ-ի էլեկտրոֆորեզից հետո ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո հանեք ԴՆԹ-ի բեկորի մեկ շերտագիծը ագարոզայի գելից:Խորհուրդ է տրվում օգտագործել ներծծող թուղթ՝ գելի ակնհայտ խոնավությունը կլանելու և գելի կտորի չափը նվազագույնի հասցնելու համար՝ հնարավորինս հեռացնելով ավելորդ ագարոզա:Կշռեք գելի կտորը (առանց միկրոցենտրիֆուգային խողովակի)՝ դրա ծավալը հաշվարկելու համար. 100 մգ գել շերտի ծավալը մոտավորապես 100 մկլ է՝ ենթադրելով, որ խտությունը 1 գ/մլ է:
2. Ավելացրեք հավասար ծավալ բուֆերային ՀՆԱ, ինկուբացրեք 50~55℃ ջերմաստիճանում 7-10 րոպե (ըստ գելի չափի, կարգավորեք ինկուբացիոն ժամանակը մինչև գելը լիովին լուծարվի):Ինկուբացիայի ընթացքում 2 անգամ շրջեք խողովակը:
Δ Բուֆերային ՀՆԱ-ի 1-3 ծավալների ավելացումը չի ազդի ԴՆԹ-ի վերականգնման արդյունավետության վրա:Եթե վերականգնվող ԴՆԹ բեկորը <100 bp, ապա անհրաժեշտ է ավելացնել բուֆերային ՀՆԱ-ի 3 ծավալ;երբ գելի կտորն ամբողջությամբ լուծվի, ավելացրեք 1 ծավալ իզոպրոպանոլ և մանրակրկիտ խառնեք, ապա շարունակեք հաջորդ քայլին:
3. Հակիրճ ցենտրիֆուգեք՝ նմուշը խողովակի հատակին հասցնելու համար, տեղադրեք FastPure DNA Mini Columns-G 2 մլ հավաքածուի խողովակների մեջ, զգուշորեն տեղափոխեք լուծույթը առավելագույնը 700 մկլ մեկ անգամ։
ժամանակը մինչև ֆիլտրման սյուները, ցենտրիֆուգեք 12000 պտ/րոպե արագությամբ (13800 X գ) 30-60 վայրկյան:
4. Հեռացրեք ֆիլտրատը և սյունակում ավելացրեք 300 մկլ բուֆերային ՀՆԱ, ինկուբացրեք սենյակային ջերմաստիճանում 1 րոպե, ցենտրիֆուգեք 12,000 պտ/րոպում (13,800 X գ) 30-60 վայրկյան:
5. Հեռացրեք ֆիլտրատը և ավելացրեք 700 մկլ բուֆերային GW (ստուգեք, արդյոք նախապես ավելացվել է բացարձակ էթանոլ) սյունակում, ցենտրիֆուգեք 12,000 rpm (13,800 X գ) 30-60 վայրկյան:
Δ Խնդրում ենք ավելացնել Buffer GW կլանման սյունակի պատի շուրջը, կամ ավելացնել Buffer GW հետևի կափարիչը և խառնել այն գլխիվայր 2-3 անգամ, որպեսզի օգնի ամբողջությամբ լվանալ աղը, որը կպչում է խողովակի պատին:
6. Կրկնել 5-րդ քայլը:
Δ Բուֆեր GW-ով երկու անգամ լվանալը կարող է ապահովել աղի ամբողջական հեռացումը և վերացնել ազդեցությունը հետագա փորձերի վրա:
7. Հեռացրեք ֆիլտրատը և ցենտրիֆուգեք դատարկ սյունը 12,000 ռ/րոպե արագությամբ (13,800 X գ) 2 րոպե:
8. Սյունակը մտցրեք մաքուր 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, ավելացրեք 20 - 30 μL Elution Buffer սյունակի մեմբրանի կենտրոնում, ինկուբացրեք 2 րոպե, այնուհետև ցենտրիֆուգեք 12,000 rpm (13,800 X գ) 1 րոպե:Հեռացրեք սյունակը, ստացված ԴՆԹ-ն պահեք -20 ջերմաստիճանում:
Δ Քայլ 8-ի սուպերնաթանտը սյունակ տեղափոխելը նորից զտելու համար և լուծույթի բուֆերը նախապես տաքացնելը մինչև 55 (երբ ԴՆԹ-ի հատվածը >3 կբ) կարող է օգտակար լինել վերականգնման արդյունավետությունը բարձրացնելու համար:
PCR արտադրանքի վերականգնման ծրագիր
Այս արձանագրությունը կիրառելի է PCR արտադրանքներից, ֆերմենտային ռեակցիայի համակարգից և ԴՆԹ-ի այլ չմշակված արտադրանքներից (ներառյալ գենետիկ ԴՆԹ) ԴՆԹ-ի բեկորները մաքրելու համար:Այս լուծումը կարող է արդյունավետ կերպով հեռացնել տարբեր նուկլեոտիդներ, պրայմերներ, պրայմերային դիմերներ, աղի մոլեկուլներ, ֆերմենտներ և այլ կեղտեր:
1. Համառոտ ցենտրիֆուգեք PCR արտադրանքները, ֆերմենտային ռեակցիայի լուծույթը և ԴՆԹ-ի այլ չմշակված արտադրանքները:Գնահատեք դրանց ծավալը պիպետտով և տեղափոխեք ստերիլիզացված 1,5 մլ կամ 2 մլ խողովակի մեջ։Ավելացրեք ddH2O մինչև ծավալը մինչև 100 μL;մինչդեռ բարձր կոնցենտրացիայով գենոմային ԴՆԹ-ի դեպքում ddH2O-ով մինչև 300 μL նոսրացումը կօգնի բարելավել վերականգնման արդյունավետությունը:
2. Ավելացնել բուֆերային ՀՆԱ-ի 5 հատոր, մանրակրկիտ խառնել՝ շրջելով կամ պտտեցնելով:Եթե ԴՆԹ-ի հետաքրքրություն ներկայացնող հատվածը >100 bp, ապա պետք է ավելացվի լրացուցիչ 1,5 ծավալ (նմուշ + բուֆերային ՀՆԱ) էթանոլ:
3. Սյունակը նորից մտցրեք հավաքման խողովակի մեջ, խառնուրդը տեղափոխեք սյունակ, ցենտրիֆուգեք 12000 պտ/րոպե արագությամբ (13800 ×գ) 30 – 60 վայրկյան:Եթե խառը լուծույթի ծավալը ավելի քան 700 µL է, ապա կլանման սյունակը նորից դրեք հավաքման խողովակի մեջ, մնացած լուծույթը տեղափոխեք կլանման սյուն և ցենտրիֆուգեք 12,000 ռ/րոպե արագությամբ (13,800 × գ) 30 – 60 վայրկյան:
4. Հաջորդ կատարումը վերաբերում է 08- 1/Գել արդյունահանման ծրագրի 5 – 8 քայլին:
Դիմումներ
TAE կամ TBE ագարոզայի գելի տարբեր կոնցենտրացիաներ;PCR արտադրանքները, ֆերմենտային ռեակցիայի համակարգերը կամ այլ հում ԴՆԹ արտադրանքները, որոնք ստացվում են տարբեր մեթոդներով:Վերականգնված բեկորները տատանվում էին70 bp -20 kb.
Նշումներ
Միայն հետազոտական օգտագործման համար:Չի օգտագործվում ախտորոշիչ ընթացակարգերում:
1. Օգտագործելուց առաջ ավելացնել 80 մլ էթանոլ բուֆերային GW-ի նոսրացմանը, ինչպես նշված է պիտակի վրա, պահել սենյակային ջերմաստիճանում:
2. Եթե բուֆերային ՀՆԱ-ն հեշտ է նստել ցածր ջերմաստիճանում պահեստավորման ժամանակ, այն կարող է որոշ ժամանակով տեղադրվել սենյակային ջերմաստիճանում, նախքան օգտագործելը:Անհրաժեշտության դեպքում այն կարելի է նախապես տաքացնել 37℃ ջրային բաղնիքում, մինչև նստվածքն ամբողջությամբ լուծարվի, այնուհետև կարելի է օգտագործել խառնելուց հետո։
3. Նախապես սահմանեք ջրի բաղնիքի ջերմաստիճանը 50 ~ 55℃:
4. 08-1/Գել արդյունահանման ծրագրի քայլ 1-ում գելի կտորի չափը նվազագույնի հասցնելը զգալիորեն կնվազեցնի տարրալուծման ժամանակը և կբարձրացնի վերականգնման արդյունավետությունը (գծային ԴՆԹ-ն հեշտությամբ հիդրոլիզվում է, երբ անընդհատ ենթարկվում է բարձր ջերմաստիճանում):ԴՆԹ գելը երկար ժամանակ մի՛ ենթարկեք ուլտրամանուշակագույն ճառագայթների ազդեցությանը, քանի որ ուլտրամանուշակագույն լույսը կարող է ԴՆԹ-ի վնաս պատճառել:
5. Ամբողջովին լուծեք գելը 08- 1/Գել արդյունահանման ծրագրի քայլ 2-ում, հակառակ դեպքում ԴՆԹ-ի վերականգնման արդյունավետությունը լրջորեն կազդի:
6. Preheat Elution Buffer-ը կամ ddH2O-ը մինչև 55℃, որն օգտակար է ԴՆԹ-ի լուծարման արդյունավետությունը բարելավելու համար:Խորհուրդ է տրվում ԴՆԹ-ն պահել 2,5 մՄ տրիս-HCl էլուենտում, pH 7,0 – 8,5:
