Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG կամ UDG) E.coli-ի ռեկոմբինանտ կլոն է՝ 25 կԴա մոլեկուլային քաշով:Այն կատալիզացնում է ազատ ուրացիլի արտազատումը ուրացիլ պարունակող միաշղթա և երկշղթա ԴՆԹ-ից և ակտիվ չէ ՌՆԹ-ի նկատմամբ և կարող է օգտագործվել PCR ուժեղացման արտադրանքի աղտոտումը կանխելու համար:Գործողության սկզբունքը հիմնված է այն փաստի վրա, որ եթե dUTP-ն փոխարինվի dTTP-ով PCR ռեակցիայում և ձևավորվի PCR ուժեղացման արտադրանք, որը պարունակում է dU հիմքեր, ֆերմենտը կարող է ընտրողաբար կոտրել U հիմքերի գլիկոզիդային կապը միաշղթա և երկշղթա: ԴՆԹ-ն և քայքայել PCR ուժեղացման արտադրանքը:
Առաջարկվող հայտ
Աղտոտման կանխարգելման ուժեղացում
Պահպանման պայման
-20°C երկարատև պահպանման համար, օգտագործելուց առաջ պետք է լավ խառնել, խուսափել հաճախակի սառցակալումից:
Պահպանման բուֆեր
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glycerol:
Միավորի սահմանում
Ֆերմենտի քանակությունը, որն անհրաժեշտ է dU հիմքեր պարունակող 1 մկգ միաշղթա ԴՆԹ-ի քայքայման համար 1 ժամում 37°C ջերմաստիճանում կազմում է 1 միավոր:
Որակի հսկողություն
1.SDS-PAGE էլեկտրոֆորետիկ մաքրություն ավելի քան 98%
2.Ուժեղացման զգայունություն, խմբաքանակի հսկողություն, կայունություն
3.1U UNG-ը 2 րոպե 50℃ ջերմաստիճանում մշակելուց հետո, 103 օրինակից ցածր U պարունակող ձևանմուշը պետք է ամբողջությամբ քայքայվի, և ուժեղացման արտադրանք չի կարող արտադրվել:
4.Էկզոգեն նուկլեազային ակտիվություն չկա
Հրահանգներ
| Բաղադրիչներ | Ծավալը (μL) | Վերջնական կոնցենտրացիան |
| 10 × PCR բուֆեր (dNTP ազատ, Mg²+անվճար) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 մկմ |
| dUTP (փոխարինել dTTP) | - | 200-600 մկմ |
| 25 մՄ MgCl2 | 2-8 մլ | 1-4 մմ |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixա | 2 | 1× |
| Կաղապար | - | ＜1 μg/ռեակցիա |
| ddH2O | Մինչև 50 | - |
Նշում: a. Եթե օգտագործվում է qPCR/qRT-PCR-ի համար, ապա լյումինեսցենտային զոնդը պետք է ավելացվի ռեակցիայի համակարգում:Սովորաբար, 0,2 մկմ պրիմերի վերջնական կոնցենտրացիան կարող է լավ արդյունքներ տալ;երբ ռեակցիայի արդյունավետությունը վատ է, այբբենարանի կոնցենտրացիան կարող է ճշգրտվել 0,2-1 մկմ միջակայքում:Սովորաբար, զոնդի կոնցենտրացիան օպտիմիզացված է 0,1-0,3 մկմ միջակայքում:Համակենտրոնացման գրադիենտ փորձեր կարող են իրականացվել՝ գտնելու այբբենարանի և զոնդի լավագույն համադրությունը:
Նշումներ
1.UNG ֆերմենտը կարող է օգտագործվել աղտոտված dUTP ուժեղացման արտադրանքը ռեակցիայի համակարգից հեռացնելու համար մինչև PCR ուժեղացման ռեակցիան, այնուհետև արտադրանքի աղտոտվածության պատճառով կեղծ դրական արդյունքներից խուսափելու համար:
2.UNG ֆերմենտի օպտիմալ ջերմաստիճանը, որը պետք է օգտագործվի հակաաղտոտման PCR ռեակցիայի ժամանակ, ընդհանուր առմամբ 50℃ է 2 րոպեի ընթացքում;ապաակտիվացման պայմանը 95℃ է 5 րոպեի ընթացքում:
3.Խուսափեք հաճախակի սառցակալումից և մի ենթարկվեք ջերմաստիճանի մեծ տատանումների:
4.Ամրապնդվող տարբեր գեները ունեն dUTP-ի օգտագործման տարբեր արդյունավետություն և զգայունություն UNG ֆերմենտի նկատմամբ, հետևաբար, եթե UNG համակարգի օգտագործումը հանգեցնում է հայտնաբերման զգայունության նվազմանը, ռեակցիայի համակարգը պետք է կարգավորվի և օպտիմիզացվի, եթե տեխնիկական աջակցության կարիք ունեք, խնդրում ենք դիմել: մեր Ընկերությունը.
