Վակցինիայի վիրուսը ծածկող ֆերմենտ

Vaccinia վիրուսը ծածկող ֆերմենտը ստացվում է ռեկոմբինանտ E. coli շտամից, որը կրում է Vaccinia ծածկող ֆերմենտի գեները:Այս մեկ ֆերմենտը կազմված է երկու ենթամիավորներից (D1 և D12) և ունի երեք ֆերմենտային ակտիվություն (ՌՆԹ տրիֆոսֆատազ և գուանիլիլտրանսֆերազ՝ D1 ենթամիավորով և գուանին մեթիլտրանսֆերազ՝ D12 ենթամիավորով)։Vaccinia virus Capping Enzyme-ն արդյունավետ է կատալիզացնում է գլխարկի կառուցվածքի ձևավորումը, որը կարող է հատուկ կցել 7-մեթիլգուանիլատի գլխարկի կառուցվածքը (m7Gppp, գլխարկ 0) ՌՆԹ-ի 5' ծայրին:Կափարիչի կառուցվածքը (Cap 0) կարևոր դեր է խաղում էուկարիոտներում mRNA կայունացման, տեղափոխման և թարգմանության մեջ:ՌՆԹ-ի փակումը ֆերմենտային ռեակցիայով արդյունավետ և պարզ մեթոդ է, որը կարող է զգալիորեն բարելավել ՌՆԹ-ի կայունությունն ու թարգմանությունը in vitro տրանսկրիպցիայի, տրանսֆեկցիայի և միկրոներարկման համար:

Բաղադրիչներ

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10×Ծածկման բուֆեր

Պահպանման պայմանները

-25～- 15℃ պահպանման համար (Խուսափեք սառեցման-հալման կրկնվող ցիկլերից)

Պահպանման բուֆեր

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% գլիցերին:

Միավորի սահմանում

Վակցինիայի վիրուսի ծածկման ֆերմենտի մեկ միավորը սահմանվում է որպես ֆերմենտի քանակություն, որն անհրաժեշտ է 10 pmol GTP 80nt տառադարձման մեջ 1 ժամվա ընթացքում 37°C ջերմաստիճանում ներառելու համար:

Որակի հսկողություն

Էկզոնուկլեազ:10 U Vaccinia վիրուսի ծածկող ֆերմենտը 1 μg λ-Hind III ԴՆԹ-ով 37 ℃ մարսող ԴՆԹ-ով 16 ժամվա ընթացքում չի քայքայվում, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:

Էնդոնուկլեազ:10 U Vaccinia վիրուսը ծածկող ֆերմենտը 1 μg λDNA-ով 37℃ 16 ժամվա ընթացքում չի տալիս դեգրադացիա, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:

Nickase:10 U Vaccinia վիրուսը ծածկող ֆերմենտը 1 μg pBR322-ով 37 ℃ 16 ժամվա ընթացքում չի քայքայվում, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելով էլեկտրոֆորեզով:

RNase:10 U Vaccinia վիրուսը ծածկող ֆերմենտը 1,6 μg MS2 RNA 4 ժամվա ընթացքում 37℃ ջերմաստիճանում չի տալիս դեգրադացիա, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:

1.coli ԴՆԹ:10 U Vaccinia virus Capping Enzyme-ը ստուգվում է E. coli-ի գենոմային ԴՆԹ-ի առկայության համար՝ օգտագործելով TaqMan qPCR E. coli 16S rRNA տեղանքի համար հատուկ պրայմերներով:E. coli-ի գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը ≤1 E. coli գենոմն է:

2.Բակտերիալ Էնդոտոքսին. LAL-թեստ, ըստ չինական Pharmacopoeia IV 2020 հրատարակության, գելի սահմանաչափի փորձարկման մեթոդ, ընդհանուր կանոն (1143):Բակտերիալ էնդոտոքսինի պարունակությունը պետք է լինի ≤10 ԵՄ/մգ:

Ռեակցիայի համակարգ և պայմաններ

1. Կափարիչ արձանագրություն (ռեակցիայի ծավալը՝ 20 μL)

Այս պրոցեդուրան կիրառելի է 10 մկգ ՌՆԹ-ի (≥100 նտ) կափարիչ ռեակցիայի համար և այն կարող է մեծացվել՝ ըստ փորձարարական պահանջների:

I) Միավորել 10 մկգ ՌՆԹ-ն և առանց նուկլեազի H2O-ը 1,5 մլ միկրոֆուգային խողովակի մեջ մինչև 15,0 µL վերջնական ծավալը:*10×Capping Buffer՝ 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) Տաքացնել 65℃ 5 րոպե, որին հաջորդում է սառցե լոգանք 5 րոպե:

3) Նշված հերթականությամբ ավելացրեք հետևյալ բաղադրիչները

*10×Capping Buffer: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) Ինկուբացնել 37°C-ում 30 րոպե, ՌՆԹ-ն այժմ ծածկված է և պատրաստ է ներքևում կիրառման համար:

2. 5′ տերմինալ պիտակավորման ռեակցիա (ռեակցիայի ծավալը. 20 μL)

Այս արձանագրությունը նախատեսված է 5' եռաֆոսֆատ պարունակող ՌՆԹ-ի պիտակավորման համար և այն կարող է մեծացվել ըստ պահանջների:Պիտակի ներդրման արդյունավետության վրա կազդի ՌՆԹ-ի մոլային հարաբերակցությունը` GTP, ինչպես նաև ՌՆԹ-ի նմուշներում GTP-ի պարունակությունը:

1) Միավորել համապատասխան քանակությամբ ՌՆԹ և առանց նուկլեազի H2O 1,5 մլ միկրոֆուգային խողովակի մեջ մինչև 14,0 µL վերջնական ծավալը:

2) Տաքացնել 65℃ 5 րոպե, որին հաջորդում է սառցե լոգանք 5 րոպե:

3) Ավելացրեք հետևյալ բաղադրիչները նշված հերթականությամբ.

** GTP MIX-ը վերաբերում է GTP-ին և փոքր թվով մարկերներին:GTP-ի կոնցենտրացիայի համար տե՛սԾանոթագրություն 3.

4) Ինկուբացնել 37°C-ում 30 րոպե, ՌՆԹ-ի 5′ վերջն այժմ պիտակավորված է և պատրաստ է հոսանքին ներքև

Դիմումներ

1. Կափարիչ mRNA-ն նախքան թարգմանչական վերլուծությունները/in vitro թարգմանությունը

2. ՄՌՆԹ-ի 5' վերջի պիտակավորում

Օգտագործման վերաբերյալ նշումներ

1.Տաքացնելով ՌՆԹ-ի լուծույթը ինկուբացիայից առաջ Vaccinia Capping Enzyme-ով հեռացնում է երկրորդական կառուցվածքը տառադարձության 5' վերջում:Ժամանակը երկարացրեք մինչև 60 րոպե հայտնի բարձր կառուցվածքային 5 ծայրերով տառադարձումների համար:

2. Կափարիչային ռեակցիաների համար օգտագործվող ՌՆԹ-ն պետք է մաքրվի օգտագործելուց առաջ և կասեցվի նուկլեազազերծ ջրի մեջ:EDTA-ն չպետք է առկա լինի, և լուծույթը պետք է զերծ լինի աղերից:

3. 5' ծայրը պիտակավորելու համար GTP-ի ընդհանուր կոնցենտրացիան պետք է լինի ռեակցիայի մեջ mRNA-ի մոլային կոնցենտրացիան 1-3 անգամ:

4. Ռեակցիոն համակարգի ծավալը կարող է մեծացվել կամ իջեցվել ըստ իրականի: