PNGase F
Պեպտիդ-N-գլիկոզիդազ F(PNGase F) ամենաարդյունավետ ֆերմենտային մեթոդն է գլիկոպրոտեիններից գրեթե բոլոր N-կապակցված օլիգոսաքարիդները հեռացնելու համար:PNGase F-ը ամիդազ է, որը ճեղքվում է N-կապակցված գլիկոպրոտեիններից բարձր մանոզայի, հիբրիդային և բարդ օլիգոսաքարիդների ներքին մեծամասնության GlcNAc և ասպարագինի մնացորդների միջև:
Դիմում
Այս ֆերմենտը օգտակար է սպիտակուցներից ածխաջրերի մնացորդները հեռացնելու համար։
Պատրաստում և ճշգրտում
| Արտաքին տեսք | Անգույն հեղուկ |
| Սպիտակուցի մաքրություն | ≥95% (SDS-PAGE-ից) |
| Գործունեություն | ≥500000 U/mL |
| Էկզոգլիկոզիդազ | Գործողություն չի հայտնաբերվել (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Էնդոգլիկոզիդազ F2 | ND |
| Էնդոգլիկոզիդազ F3 | ND |
| Էնդոգլիկոզիդազ Հ | ND |
| Պրոթեզերոն | ND |
Հատկություններ
| EC համարը | 3.5.1.52(Ռեկոմբինանտ միկրոօրգանիզմից) |
| Մոլեկուլային քաշը | 35 կԴա (SDS-PAGE) |
| Իզոէլեկտրական կետ | 8. 14 |
| Օպտիմալ pH | 7,0-8,0 |
| Օպտիմալ ջերմաստիճան | 65 °C |
| Ենթաշերտի առանձնահատկությունը | GlcNAc-ի և ասպարագինի մնացորդների միջև գլիկոզիդային կապերի ճեղքում Նկ.1 |
| Ճանաչման կայքեր | N-կապակցված գլիկաններ, եթե չեն պարունակում α1-3 ֆուկոզա Նկ. 2 |
| Ակտիվատորներ | DTT |
| Արգելակիչ | SDS |
| Պահպանման ջերմաստիճանը | -25 ~ -15 ℃ |
| Ջերմային անակտիվացում | 20 մկլ ռեակցիայի խառնուրդը, որը պարունակում է 1 մկլ PNGase F, ապաակտիվացվում է 10 րոպե ինկուբացիայի միջոցով 75 °C-ում: |
Նկ. 1 PNGase F-ի ենթաշերտի առանձնահատկությունը
Նկ. 2 PNGase F-ի ճանաչման դիրքերը:
Երբ ներքին GlcNAc մնացորդները կապված են α1-3 ֆուկոզայի հետ, PNGase F-ը չի կարող բաժանել N-կապակցված օլիգոսաքարիդները գլիկոպրոտեիններից:Այս փոփոխությունը տարածված է բույսերի և որոշ միջատների գլիկոպրոտեինների մեջ:
Cբաղադրիչները
|
| Բաղադրիչներ | Համակենտրոնացում |
| 1 | PNGase F | 50 մկլ |
| 2 | 10×Գլիկոպրոտեին դենատորացնող բուֆեր | 1000 մկլ |
| 3 | 10×Գլիկոբուֆեր 2 | 1000 մկլ |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 մկլ |
Միավորի սահմանում
Մեկ միավոր (U) սահմանվում է որպես ֆերմենտի քանակություն, որն անհրաժեշտ է ածխաջրերի >95%-ը հեռացնելու համար 10 մկգ դենատուրացված RNase B-ից 1 ժամում 37°C ջերմաստիճանում 10 մկլ ռեակցիայի ընդհանուր ծավալով:
Ռեակցիայի պայմանները
1. Լուծել 1-20 մկգ գլիկոպրոտեին դեիոնացված ջրով, ավելացնել 1 մկլ 10×գլիկոպրոտեին դենատուրացնող բուֆեր և H2O (անհրաժեշտության դեպքում), որպեսզի ստացվի 10 մկլ ռեակցիայի ընդհանուր ծավալ:
2.Ինկուբացնել 100°C-ում 10 րոպե, սառեցնել սառույցի վրա։
3.Ավելացնել 2 μl 10×GlycoBuffer 2, 2 μl 10% NP-40 և խառնել:
4.Ավելացնել 1-2 մկլ PNGase F և H2O (անհրաժեշտության դեպքում), որպեսզի ստացվի 20 մկլ ռեակցիայի ընդհանուր ծավալ և խառնվի:
5.Ինկուբացնել ռեակցիան 37°C ջերմաստիճանում 60 րոպե:
6.SDS-PAGE վերլուծության կամ HPLC վերլուծության համար:
