mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2' -O-methyltransferase ստացվել է ռեկոմբինանտ E. coli շտամից, որը կրում է vaccinia mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase գենը:Այս ֆերմենտը ավելացնում է մեթիլ խումբ առաջին նուկլեոտիդի 2'-O դիրքում, որը հարում է գլխարկի կառուցվածքին ՌՆԹ-ի 5' վերջում: Ֆերմենտը օգտագործում է S-ադենոզիլմեթիոնինը (SAM) որպես մեթիլ դոնոր՝ ծածկված ՌՆԹ-ի մեթիլացման համար (կափարիչ): -0) ստացվում է գլխարկ- 1 կառուցվածք.

Cap1 կառուցվածքը կարող է մեծացնել թարգմանության արդյունավետությունը՝ բարելավելով mRNA-ի արտահայտումը տրանսֆեկցիոն և միկրոներարկման փորձերում: Այս ֆերմենտը հատուկ պահանջում է RNA՝ m7GpppN գլխարկով որպես սուբստրատ:Այն չի կարող օգտագործել ՌՆԹ-ն pN, ppN, pppN կամ GpppN 5' վերջում:Կափարիչ ՌՆԹ-ն կարող է պատրաստվել in vitro տրանսկրիպցիայի միջոցով՝ օգտագործելով գլխարկի անալոգը կամ ֆերմենտային ծածկույթի միջոցով՝ օգտագործելով Vaccinia Capping Enzyme:

Բաղադրիչներ

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Պահպանում

-25 ～- 15 ℃ պահպանման համար (Խուսափեք սառեցման-հալման կրկնվող ցիկլերից)

Պահպանման բուֆեր

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% գլիցերին:

Միավորի սահմանում

Մեկ միավորը սահմանվում է որպես ֆերմենտի քանակություն, որն անհրաժեշտ է 10 պմոլ 80 նտ ծածկված ՌՆԹ տառադարձման մեթիլացման համար 1 ժամում 37°C-ում:

Որակի վերահսկման փորձարկումներ

Էկզոնուկլեազ50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase 1μg λ-Hind III ԴՆԹ-ի 37 ℃ մարսման հետ 16 ժամվա ընթացքում չի տալիս քայքայում, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:

Էնդոնուկլեազ50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase 1 μg λDNA-ի հետ 37℃ 16 ժամվա ընթացքում չի քայքայվում, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:

Նիկաս50U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase 1 μg pBR322 37 ℃ 16 ժամվա ընթացքում չի դեգրադացվում, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով:

RNase50U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase 1.6 μg MS2 RNA-ի հետ 4 ժամ 37℃ ջերմաստիճանում չի քայքայվում, ինչպես որոշվում է ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզով:

E. coli ԴՆԹ50U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase-ն ստուգվում է առկայության համարE. coli գենոմային ԴՆԹ՝ օգտագործելով TaqMan qPCR՝ հատուկ պրայմերներովE. coli 16S rRNA տեղանք:ԱյնE. coli գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը =1 էE. coli գենոմը.

Բակտերիալ ԷնդոտոքսինLAL-թեստ, համաձայն չինական Pharmacopoeia IV 2020 հրատարակության, գելի սահմանաչափի փորձարկման մեթոդ, ընդհանուր կանոն (1143):Բակտերիալ էնդոտոքսինի պարունակությունը պետք է լինի =10 ԵՄ/մգ:

Ռեակցիայի համակարգ և պայմաններ

1. Միավորել համապատասխան քանակություն Կափարիչ ՌՆԹ-ի և RNase-ից զերծ H2O-ի 1,5 մլ միկրոֆուգային խողովակի մեջ մինչև 16,0 µL վերջնական ծավալը:

2. Տաքացնել 65℃ 5 րոպե, որից հետո 5 րոպե սառցե լոգանք ընդունել:

3. Նշված հերթականությամբ ավելացրեք հետևյալ բաղադրիչները (Caped RNA-ի մեթիլացման համար

10-ից պակաս

*10× Կափարիչ ռեակցիայի բուֆեր՝ 500 մՄ Տրիս-HCl (pH 8.0, 25℃), 50 մՄ KCl, 10 մՄ MgCl2 、 10 մՄ DTT:

4. Ինկուբացնել 37℃ ջերմաստիճանում 1 ժամ (խորհուրդ է տրվում 2 ժամ ինկուբացիա 200 նտ-ից պակաս թիրախային հատվածի համար):

Դիմումներ

ՄՌՆԹ-ի արտահայտումը բարելավելու համար միկրոներարկման և տրանսֆեկցիոն փորձերի ժամանակ:

Օգտագործման վերաբերյալ նշումներ

1. Մինչ ռեակցիան ՌՆԹ-ն պետք է մաքրվի և լուծվի նուկլեազազերծ ջրի մեջ, բոլոր լուծույթները չպետք է պարունակեն որևէ EDTA և իոններ:

2. Առաջարկվում է ռեակցիայից առաջ 5 րոպե տաքացնել ՌՆԹ-ի նմուշը 65℃ ջերմաստիճանում, որպեսզի հեռացնեն երկրորդական կառուցվածքը տառադարձության 5´ վերջում:Այն կարող է երկարացվել մինչև 10 րոպե բարդ 5 ´-տերմինալ կառուցվածքի համար: