Կրկնաշղթա ՌՆԹ (dsRNA) ELISA KIT

Այս փաթեթը ֆերմենտային կապակցված իմունոսորբենտային անալիզ է (ELISA) զուգակցված բիոտին-Ստրեպտավիդին համակարգի հետ՝ 60 բազային զույգ (bp) բարձր երկարությամբ dsRNA-ի քանակական չափման համար՝ անկախ հաջորդականությունից:Թիթեղը նախապես պատված է հակա-dsRNA հակամարմինով:Նմուշում առկա dsRNA-ն ավելացվում է և կապվում հորերի վրա պատված հակամարմիններին:Եվ հետո ավելացվում է բիոտինիլացված հակա-dsRNA հակամարմին և կապվում նմուշի dsRNA-ին:Լվացքից հետո ավելացվում է HRP-Streptavidin և կապվում է Biotinylated anti-dsRNA հակամարմինին:Ինկուբացիայից հետո չկապված HRP-Streptavidin-ը լվանում է:Այնուհետև ավելացվում է TMB սուբստրատի լուծույթ և կատալիզացվում է HRP-ով, որպեսզի ստացվի կապույտ գույնի արտադրանք, որը վերածվել է դեղինի՝ թթվային կանգառի լուծույթ ավելացնելուց հետո:Դեղինի խտությունը համաչափ է ափսեում գրավված dsRNA-ի թիրախային քանակին:Կլանումը չափվում է 450 նմ:

Դիմում

Այս հավաքածուն նախատեսված է մնացորդային dsRNA-ի քանակական չափման համար:

Կոմպլեկտի բաղադրիչներ

Պահպանում և կայունություն

1. Չօգտագործված հավաքածուի համար. ամբողջ փաթեթը կարող է պահվել 2~8℃ ջերմաստիճանի պայմաններում:Պահպանման կայունության համար պետք է խուսափել ուժեղ լույսից:

2. Օգտագործված հավաքածուի համար. Երբ միկրոսալը բացվի, խնդրում ենք ծածկել չօգտագործված հորերը ափսեի կնիքով և վերադարձնել փայլաթիթեղի տոպրակը, որը պարունակում է չորացուցիչի փաթեթը, փակել փայլաթիթեղի տոպրակը և օգտագործելուց հետո որքան հնարավոր է շուտ վերադարձնել 2~8℃ ջերմաստիճանի:Այլ ռեակտիվները պետք է վերադարձվեն 2~8℃ ջերմաստիճանի, որքան հնարավոր է շուտ օգտագործելուց հետո:

Պահանջվող, բայց չմատակարարված նյութեր

1. Microplate reader 450±10nm ֆիլտրով (ավելի լավ է, եթե հնարավոր լինի հայտնաբերել 450 և 650 նմ ալիքի երկարությամբ):

2. Միկրոափսե թափահարող.

3. ՌՆազազերծ ծայրեր և ցենտրիֆուգային խողովակներ:

Գործողության հոսքի աղյուսակ

Մինչ դուք սկսեք

1. Կոմպլեկտի բոլոր բաղադրիչները և նմուշները օգտագործելուց առաջ բերեք սենյակային ջերմաստիճանի (18-25℃):Եթե ​​փաթեթը չի սպառվի մեկ անգամ, խնդրում ենք հանել միայն շերտերն ու ռեագենտները ներկա փորձի համար, իսկ մնացած շերտերն ու ռեագենտները թողնել անհրաժեշտ վիճակում:

2. Լվացքի բուֆեր. նոսրացրեք 40 մլ 20× խտացված լվացքի բուֆեր 760 մլ դեոնացված կամ թորած ջրով, որպեսզի պատրաստեք 800 մլ 1× լվացքի բուֆեր:

3. Ստանդարտ. Օգտագործելուց առաջ հակիրճ պտտել կամ ցենտրիֆուգել լուծույթը:Տրամադրված չորս ստանդարտների կոնցենտրացիան 5նգ/մլ է:UTP և pUTP dsRNA ստանդարտների համար խնդրում ենք նոսրացնել պաշարային լուծույթը մինչև 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL STE բուֆերով՝ ստանդարտ կորը գծելու համար:N1-Me-pUTP dsRNA ստանդարտների համար խնդրում ենք նոսրացնել պաշարային լուծույթը մինչև 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL STE բուֆերով՝ ստանդարտ կորը գծելու համար:5-OMe-UTP dsRNA ստանդարտի համար խնդրում ենք նոսրացնել պաշարային լուծույթը մինչև 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL STE բուֆերով՝ ստանդարտ կորը գծելու համար:Մենք խորհուրդ ենք տալիս ստանդարտները նոսրացնել հետևյալ գծապատկերներով.

4. Բիոտինիլացված հայտնաբերման հակամարմիններ և HRP-streptavidin աշխատանքային լուծույթ. Օգտագործելուց առաջ հակիրճ պտտել կամ ցենտրիֆուգել պահեստային լուծույթը:Նոսրացրեք դրանք մինչև աշխատանքային կոնցենտրացիան նոսրացման բուֆերով:

5. TMB ենթակազմ. լուծույթի անհրաժեշտ չափաբաժինը ներծծեք ստերիլիզացված ծայրերով և մնացորդային լուծույթը կրկին մի թափեք սրվակի մեջ:TMB ենթակայքը զգայուն է լույսի նկատմամբ, երկար ժամանակ մի՛ ենթարկեք TMB սուբստրատը լույսի ներքո:

Օգտագործելով արձանագրություն

1. Որոշեք վերլուծության համար անհրաժեշտ շերտերի քանակը:Օգտագործման համար շերտերը տեղադրեք շրջանակների մեջ:Այս վերլուծության մեջ չօգտագործված ափսեի մնացած շերտերը պետք է վերափաթեթավորվեն տոպրակի մեջ չորացնող նյութով:Պարկը սերտորեն փակեք սառնարանում պահելու համար:

2. Ավելացրեք 100 մկլ ստանդարտ, դատարկ և նմուշների նոսրացումներից յուրաքանչյուրը համապատասխան հորերի մեջ:Ծածկեք ափսեի կնիքով:Ինկուբացնել 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում՝ թափահարելով 500 պտ/րոպում:Նմուշները պետք է նոսրացվեն STE բուֆերով մինչև համապատասխան կոնցենտրացիան ճշգրիտ վերլուծության համար:

3. Լվացքի փուլ. ներծծեք լուծույթը և լվացեք 250 մկլ լվացքի բուֆերով յուրաքանչյուր ջրհորի մոտ և թողեք այն մնա 30 վրկ:Լվացքի բուֆերը ամբողջությամբ թափեք՝ ափսեը ներծծող թղթի վրա սեղմելով:Ամբողջությամբ լվանալ 4 անգամ։

4. Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 100 մկլ կենսատինիլացված հայտնաբերման հակամարմինների աշխատանքային լուծույթ:Ծածկեք ափսեի կնիքով:Ինկուբացնել 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում` թափահարելով 500 պտ/րոպե արագությամբ:

5. Կրկնել լվացքի քայլը:

6. Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 100 μL HRP-streptavidin աշխատանքային լուծույթ:Ծածկեք ափսեի կնիքով:Ինկուբացնել 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում՝ թափահարելով 500 պտ/րոպում:

7. Կրկին կրկնել լվացքի քայլը:

8. Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 100 մկլ TMB ենթաշերտի լուծույթ:Ծածկեք ափսեի կնիքով:Ինկուբացնել 30 րոպե RT Protect-ում լույսից:Սուբստրատի լուծույթի ավելացումով հեղուկը կապտավուն կդառնա:

9. Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 50 մկլ կանգառի լուծույթ:Ստոպ լուծույթի ավելացմամբ հեղուկը կդառնա դեղին:Այնուհետև գործարկեք միկրոափսե ընթերցողը և անմիջապես կատարեք չափումներ 450 նմ-ով:

Արդյունքների հաշվարկ

1. Յուրաքանչյուր ստանդարտի, հսկիչի և նմուշի կրկնակի ընթերցումների միջին արժեքը և միջին զրոյական ստանդարտ օպտիկական խտությունը հանեք:Կառուցեք ստանդարտ կոր, որի կլանումը ուղղահայաց (Y) առանցքի վրա է, իսկ dsRNA կոնցենտրացիան հորիզոնական (X) առանցքի վրա:

2. Խորհուրդ է տրվում հաշվարկն իրականացնել կորի տեղադրման համակարգչային ծրագրերի միջոցով, ինչպիսիք են curve expert 1.3 կամ ELISA Calc-ը 5 կամ 4 պարամետրով ոչ գծային հարմարեցման մոդելում:

Կատարում

1. Զգայունություն:

հայտնաբերման ստորին սահմանը՝ ≤ 0,001 pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-ի համար):

Քանակականության ստորին սահմանը՝ 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA-ի համար), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA-ի համար), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-ի համար):

2. Ճշգրտություն՝ ներվերլուծության CV ≤10%, ինտրավերլուծության CV ≤10%

3. Վերականգնում:80%~120%

4. Գծայինություն.0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(N1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA-ի համար):

Նկատառումներ

1. TMB արձագանքման ջերմաստիճանը և ժամանակը կարևոր են, խնդրում ենք վերահսկել դրանք խստորեն համաձայն հրահանգի:

2. Վերարտադրման լավ վերարտադրելիության և զգայունության հասնելու համար թիթեղների պատշաճ լվացումը չափազանց կարևոր է, որպեսզի հեռացնեն չհակազդող ռեակտիվները:

3. Օգտագործելուց առաջ բոլոր ռեակտիվները պետք է մանրակրկիտ խառնվեն և նմուշի կամ ռեակտիվների ավելացման ժամանակ խուսափեն փչելուց:

4. Եթե խտացված լվացքի բուֆերում բյուրեղներ են գոյացել (20x), տաքացրեք մինչև 37℃ և նրբորեն խառնեք, մինչև բյուրեղները լիովին լուծվեն:

5. Խուսափեք նատրիումի ազիդ (NaN3) պարունակող նմուշների վերլուծությունից, քանի որ այն կարող է ոչնչացնել HRP-ի ակտիվությունը՝ հանգեցնելով dsRNA-ի քանակի թերագնահատմանը:

6. Փորձաքննության ընթացքում խուսափեք RNase-ով աղտոտումից:

7. Ստանդարտ/նմուշը, հայտնաբերման հակամարմինը և SA-HRP-ը նույնպես կարող են իրականացվել RT-ում՝ առանց ցնցումների, բայց դա կարող է հանգեցնել հայտնաբերման զգայունության մեկ անգամ նվազմանը:Այս դեպքում մենք խորհուրդ ենք տալիս UTP և pUTP dsRNA ստանդարտները նոսրացնել 2pg/μL-ից, N1-Me-pUTP dsRNA ստանդարտները պետք է նոսրացվեն 4pg/μL-ից, իսկ 5-OMe-UTP dsRNA ստանդարտները պետք է նոսրացվեն 8pg/μL-ից:Բացի այդ, HRP-streptavidin աշխատանքային լուծույթը ինկուբացրեք 60 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Մի օգտագործեք կոլբայի թափահարում, քանի որ կոլբայի թափահարողը կարող է հանգեցնել ոչ ճշգրիտ արդյունքի:

Տիպիկ արդյունք

1. Ստանդարտ կորի տվյալներ

2. Ստանդարտ կորի հաշվարկ

3. Գծաներկի հայտնաբերման միջակայքը՝ 0.0312- 1pg/μL